- Caractéristiques de la protéinase K
- Activité enzymatique
- Applications
- Avantages de la protéinase K
- Protéines résistantes à la protéinase K
- Références
La K protéinase est une enzyme appartenant au groupe des sérine protéases, c'est-à-dire qu'elle a en son milieu une sérine d'acide aminé catalytiquement active et a pour fonction de rompre les liaisons peptidiques par hydrolyse. À son tour, cette enzyme appartient à la famille des protéines de subtilisine (peptidase S8).
La protéinase K a un poids moléculaire (MW) de 28 900 daltons et a été isolée pour la première fois en 1974 dans des extraits du champignon Engyodontium album, précédemment connu sous le nom de Tritirachium album Limber.
Structure moléculaire de la protéinase K.Source: Lykchiniadis
Il a une capacité protéolytique élevée, démontrée par sa capacité à dégrader la kératine présente dans les cheveux. Le mot kératine en anglais est orthographié "kératine", d'où son nom de "protéinase K".
En raison de son pouvoir élevé de cliver les protéines natives, cette enzyme est utile dans diverses techniques de biologie moléculaire. Il est principalement utilisé pour isoler et préparer des acides nucléiques de poids moléculaire élevé (MW).
La protéinase K agit en libérant de l'ADN nucléaire, tout en détruisant les protéines et en inactivant les RNases et les DNases, c'est-à-dire qu'elle élimine les nucléases dans les préparations d'ADN et d'ARN.
En revanche, on a vu que la protéinase K peut hydrolyser certaines protéines natives dénaturées, ce qui a suscité l'intérêt des chercheurs pour son utilisation dans l'étude des protéines prion (PrPC).
Cependant, malgré leur pouvoir protéolytique élevé, il existe des protéines résistantes à l'action de la protéinase K. Parmi elles, certaines protéines anormales appelées prions (PrPSc), associées à des encéphalopathies spongiformes transmissibles.
Caractéristiques de la protéinase K
La protéinase K a une structure tertiaire composée de trois couches, avec une feuille β à sept chaînes interposée entre deux couches d'hélices. Comme il appartient à la famille des peptidases S8, il se caractérise par la présence d'une triade catalytique dans son site actif, dont l'ordre séquentiel est (Asp, His et Ser), ce qui les différencie des autres familles de peptidases.
Cette enzyme du groupe des sérine protéases est caractérisée par l'hydrolyse des liaisons peptidiques proches du groupement carboxylique des acides aminés aliphatiques et aromatiques.
D'autre part, il est capable d'agir en présence de certaines substances corrosives, comme le dodécyl sulfate de sodium (SDS), le Tris-HCL et l'EDTA, qui sont utilisées pour aider à la dénaturation des protéines, leur faisant perdre leur structure native.
Il s'agit d'une étape préliminaire dans la préparation des protéines pour la technique d'électrophorèse. La gamme de pH à laquelle agit la protéinase K est assez large (2,0 à 12,0), avec un pH optimal entre 7,5 et 12,0 et son point isoélectrique est de 8,9. Comme on peut le voir, il est actif contre une très large gamme de pH.
Une autre caractéristique qui ressort de la protéinase K est sa stabilité en présence de températures élevées (50 - 60 ° C).
Activité enzymatique
La protéinase K nécessite la présence de l'ion calcium, bien que cela n'affecte pas son activité, si elle est essentielle pour maintenir sa stabilité.
Pour que la protéinase K digère complètement le substrat, un temps de contact d'environ 5 minutes à 2 heures est nécessaire.
Cependant, dans ce sens, Daza et al.ont comparé la pureté de l'ADN obtenu à différents moments d'exposition à la protéinase K et ont conclu qu'une incubation prolongée (jusqu'à 24 h) améliore significativement la qualité de l'ADN.
Cependant, en relation avec la concentration de l'enzyme protéinase K utilisée dans les différents protocoles, on peut dire qu'elle est très variée.
Il peut être utilisé de très faibles concentrations (5 µg / ml) à des concentrations de 500 µg / ml. Mais les concentrations de travail les plus courantes vont de 50 à 100 μg / ml, en particulier pour la digestion des protéines et l'inactivation de la nucléase. Bien que pour le traitement des tissus, une concentration de 2 mg / ml soit nécessaire.
Applications
Ses applications sont très larges et peuvent être résumées comme suit:
-Il est utilisé dans la digestion des protéines et l'extraction de l'ADN par diverses méthodes telles que: relargage, PK-SDS, bromure de cétyl-triméthylammonium (CTAB), acétate de potassium modifié et extraction à l'iodure de sodium.
-Inactivation des nucléases (RNases et DNases).
-Dans la technique d'hybridation in situ (HIS), pour favoriser la libération d'acide nucléique, en plus d'éliminer les protéines indésirables.
-Modification des protéines.
-Au niveau de la recherche, dans diverses études.
Avantages de la protéinase K
Plusieurs études comparatives ont été menées entre les techniques d'extraction d'ADN qui utilisent la protéinase K, avec d'autres qui ne l'utilisent pas et toutes concluent qu'il y a de plus grands avantages à utiliser l'enzyme. Les avantages sont les suivants:
-DNA de haut poids moléculaire, de haute qualité et pureté est obtenu.
-L'ADN extrait est stable jusqu'à 3 mois.
L'ADN extrait peut être utilisé dans les techniques suivantes: Southern blot, réaction en chaîne par polymérase (PCR), électrophorèse, entre autres.
Protéines résistantes à la protéinase K
Diverses recherches ont conclu que les prions (protéines PrPSc toxiques anormales) diffèrent des protéines PrPC (natives) en étant résistantes à l'action de la protéinase K, tandis que les PrPC sont sensibles à son action.
D'autres auteurs ont décrit que dans la structure de PrPSc il y a des parties sensibles et d'autres résistantes à la protéinase K. Cependant, les deux parties sont également toxiques et infectieuses.
D'autre part, Bastian et al.en 1987 ont isolé 4 protéines de 28, 30, 66 et 76 kda d'une espèce de Spiroplasma mirum. Tous se sont révélés résistants à l'action de la protéinase K et avaient également une réaction croisée avec certains prions.
Il est connu que cette espèce peut causer des cataractes et des dommages neurologiques importants et en raison des découvertes scientifiques de Bastian, entre autres recherches, une tentative a été faite pour lier ce micro-organisme aux encéphalopathies spongiformes transmissibles.
Cependant, l'étiologie de cette pathologie neurologique dégénérative continue d'être attribuée aux prions aujourd'hui.
En ce sens, Butler et al.en 1991 ont identifié et caractérisé une classe de protéines résistantes à la protéinase K de 40 kda à partir de deux souches de Mycoplasma hyorhinis. Ce pathogène affecte les porcs, infectant leurs tissus, mais dans ce cas, il n'y a pas eu de réaction croisée avec les prions testés.
Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour élucider de nombreuses inconnues à cet égard.
Références
- Bastian F, Jennings R et Gardner W. 1987. L'antisérum à la protéine de fibrille associée à la tremblante réagit de manière croisée avec les protéines de fibrilles de Spiroplasma miru m. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
- Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V.Évaluation d'une méthode d'extraction et de purification d'ADN à partir de tissu musculaire fixé au formaldéhyde de cadavres non identifiés. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
- Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E et Mcgarrity G. Identification et caractérisation des protéines résistantes à la protéinase K chez les membres de la classe Mollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
- López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Comparaison de deux protocoles d'extraction d'ADN de Trypanosoma cruzi cultivés en milieu axénique. Rev. Pérou. Med. Exp. Santé publique 2014; 31 (2): 222-227. Disponible sur: scielo.org
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