MILIEU LÖWENSTEIN-JENSEN: FONDATION, PRÉPARATION ET UTILISATION - LA BIOLOGIE - 2025

Le milieu Löwenstein-Jensen est un milieu solide sélectif pour l'isolement et le développement de bactéries du genre Mycobacterium, telles que Mycobacterium tuberculosis, M. avium, entre autres, à l'exception de l'espèce leprae, qui n'est pas cultivable.

Les bactéries du genre Mycobacterium ne se développant pas dans les milieux de culture conventionnels, il était donc nécessaire de concevoir un milieu spécial pour leur isolement. Le support original a été créé par Löwenstein et plus tard modifié par Jensen.

Milieu Löwenstein-Jensen avec colonies de Mycobacterium tuberculosis. Source: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., avec l'aimable autorisation de Biology Image Library

La modification a consisté à éliminer le colorant rouge Congo, en le remplaçant par une concentration plus élevée de vert malachite. Il a également modifié les concentrations de citrate de magnésium et de phosphate monopotassique.

Le milieu Löwenstein-Jensen contient actuellement de la fécule de pomme de terre, de l'asparagine, du citrate de magnésium, du phosphate monopotassique, du sulfate de magnésium, du vert de malachite, de l'acide nalidixique, du cycloheximide, de la lincomycine, des œufs battus, de la glycérine et de l'eau.

Les mycobactéries sont normalement isolées à partir de sites qui ne sont pas stériles, tels que les expectorations, l'urine, les abcès, entre autres. Cela signifie que la plupart des échantillons contiendront le microbiote habituel de la zone, plus l'agent pathogène.

C'est pourquoi le milieu Löwenstein-Jensen contient une série d'inhibiteurs dans sa composition représentés par du vert malachite, des antibiotiques et des antifongiques.

De plus, les échantillons provenant de sites non stériles doivent être décontaminés et neutralisés avant d'être ensemencés dans le milieu Löwenstein-Jensen.

Base

La présence d'oeuf et de glycérine dans le milieu Löwenstein-Jensen stimule la croissance des mycobactéries car elles fournissent les acides gras et les protéines nécessaires au développement de ces microorganismes.

Le milieu Löwenstein-Jensen contient du vert de malachite, qui est un inhibiteur du microbiote qui l'accompagne. Mais il contient également de l'acide nalidixique (35 µg / mL), qui inhibe le microbiote Gram négatif, du cycloheximide (400 µg / mL), qui inhibe les champignons et levures saprophytes, et de la lincomycine (2 µ / mL), qui inhibe le microbiote Gram positif.

Certaines sociétés commerciales préfèrent ajouter la combinaison d'antibiotiques suivante: polymyxine B 200000 unités / L, amphotéricine B 10 mg / L, carbénicilline 50 mg / L et triméthoprime 10 mg / L.

Ce milieu ne contient pas d'agar, donc la solidification du milieu se produit du fait de la coagulation de l'albumine présente dans l'œuf lors de la stérilisation.

préparation

Peser 37,3 g du milieu déshydraté dans 600 ml d'eau distillée auxquels 12 ml de glycérol ont été préalablement ajoutés. Le mélange est chauffé en agitant fréquemment jusqu'à dissolution complète. Autoclave le milieu à 121 ° C pendant 15 minutes.

En revanche, une suspension homogène de 1000 ml d'oeufs frais doit être préparée dans des conditions aseptiques. Ajouter la suspension d'oeufs aux 600 ml de milieu préparé à une température de 50 à 60 ° C en évitant les bulles d'air.

Des solutions antibiotiques sont également ajoutées après stérilisation dans l'autoclave.

Versez le milieu dans des tubes à essai stériles à bouchon à vis. Chauffer les tubes à 85 ° C pendant 45 minutes en position inclinée.

La couleur du milieu préparé est vert aigue-marine et peut présenter des taches blanchâtres en raison de la présence de lipides d'œuf.

Le pH du milieu doit être de 7,2 ± 0,2

Conserver les tubes au réfrigérateur et à l'abri de la lumière directe jusqu'à leur utilisation. Revenu avant le semis.

Il existe une modification du médium appelée "modification de Gruft du Löwenstein Jensen". Celui-ci contient les mêmes composés que le milieu classique mais de l'ARN-5 mg / 100 ml est ajouté, et comme inhibiteur, il contient du vert de malachite 0,025 g / 100 ml, de la pénicilline 50 U / ml et de l'acide nalidixique 35 ug / ml.

Applications

Le milieu de Löwenstein-Jensen est utilisé pour l'isolement de mycobactéries à partir de divers types d'échantillons. Une coloration Ziehl-Neelsen est recommandée pour tout échantillon dans lequel la présence de mycobactéries est suspectée.

Certains échantillons proviennent de sites stériles mais d'autres non. Les échantillons non stériles doivent être décontaminés le cas échéant:

Expectorations

Les échantillons d'expectorations doivent être décontaminés comme suit: déterminer la quantité d'échantillon de crachats en ml et ajouter la même quantité de NaOH à 4% à l'échantillon et incuber à 37 ° C.

Agitez fréquemment le mélange dans les 30 minutes. Centrifuger ensuite à 3000 tr / min pendant 30 minutes.

Jeter le surnageant sur une solution désinfectante phénolique. Utilisez le sédiment pour semer, mais d'abord le pH doit être neutralisé.

Pour neutraliser les sédiments, 5% H ₂ SO ₄ est utilisé en présence de l'indicateur rouge phénol jusqu'à ce qu'il atteigne un pH neutre qui provoque une coloration saumonée.

Lavage gastrique, lavage bronchique et aspiration bronchique

Dans ce cas, l'échantillon doit être centrifugé à 3000 tr / min pendant 30 minutes. Le surnageant est jeté et le culot est utilisé. Pour décontaminer les sédiments, ajouter 3 ml de NaOH à 4% et remuer fréquemment à 37 ° C pendant une demi-heure.

Centrifuger à nouveau, le surnageant est jeté et le culot est utilisé. Ce dernier doit être neutralisé comme expliqué dans l'échantillon de crachats.

Urine

Laisser l'échantillon se déposer au réfrigérateur pendant 24 heures. Séparez le surnageant. Le culot restant doit être centrifugé pendant 30 minutes à 3000 RMP. Jeter à nouveau le surnageant et reconstituer le culot avec 3 ml de solution physiologique stérile.

Ajouter 3 ml de NaOH à 4% et procéder à la décontamination et à la neutralisation comme décrit précédemment.

Liquide d'ascite, liquide pleural, liquide céphalo-rachidien

Dans ce type d'échantillon, il est centrifugé et le surnageant est jeté. Effectuer un gramme sur le sédiment ou observer directement au microscope; Si aucune bactérie n'est observée, l'étape de décontamination n'est pas nécessaire, pas plus que l'étape de neutralisation.

Dans ce cas, l'échantillon peut être ensemencé directement en utilisant le sédiment. S'il y a des bactéries, procédez à la décontamination et à la neutralisation comme décrit ci-dessus.

Les biopsies

Pour ce type d'échantillon, 5 ml d'eau distillée doivent être ajoutés à une centrifugeuse ultérieure à 1500 tr / min pendant 10 minutes. Jeter le surnageant et re-centrifuger le culot à 3500 tr / min pendant 30 minutes. Utilisez le sédiment pour semer le milieu de culture.

Écouvillon laryngé

L'écouvillon doit être placé dans un tube stérile contenant à parts égales d'eau distillée et 4% de NaOH. L'écouvillon doit être pressé contre les parois du tube afin que l'échantillon soit dilué dans le liquide. Centrifuger et utiliser les sédiments. Neutraliser les sédiments comme déjà décrit.

Semé

Le milieu de Löwenstein-Jensen est ensemencé en ajoutant 0,5 ml de l'échantillon à la surface du milieu. Faites pivoter le tube pour répartir l'échantillon dans tout le milieu. N'utilisez pas de poignée en platine.

Un deuxième tube contenant du milieu Stonebrink peut être ensemencé afin d'isoler Mycobacterium bovis et d'autres espèces qui ne poussent pas sur le milieu Löwenstein-Jensen.

Incubation

Les tubes inoculés sont incubés en aérobie à 37 ° C, avec le capuchon légèrement lâche et incliné à environ 5 ° et protégé de la lumière. L'environnement peut être enrichi de 5 à 10% de dioxyde de carbone. Vérifiez les cultures deux fois par semaine jusqu'à l'apparition des colonies.

Une fois l'échantillon absorbé, les bouchons sont resserrés. Le temps d'incubation maximal est de 8 semaines, si après cette période il n'y a pas de croissance, il est signalé comme négatif.

Contrôle de qualité

Les souches suivantes peuvent être utilisées comme contrôle qualité:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcoccus pyogenes ATCC de 19615 n ° 320, Cryptococcus pyogenes ATCC de 320CC

Un excellent développement est attendu pour les trois premières espèces mentionnées, pour M. fortuitum, la croissance devrait être bonne, tandis que pour M. bovis, une croissance faible ou nulle n'est attendue. Pendant ce temps, les espèces autres que le genre Mycobacterium doivent être totalement inhibées.

Limites

Le support préparé doit être protégé de la lumière, une exposition prolongée à la lumière fait passer le support du vert au bleu, dans ce cas le support ne peut plus être utilisé. En effet, le vert malachite est photosensible.

Le milieu, car il contient des œufs, peut être facilement contaminé s'il n'est pas manipulé de manière aseptique. Il peut être dissous s'il est contaminé par des bactéries protéolytiques.

La culture et la manipulation de bactéries du genre Mycobacterium nécessitent un personnel qualifié, conscient des mesures de biosécurité à suivre pour éviter d'être contaminé ou de contaminer les autres.

Le HCl ne doit pas être utilisé dans l'étape de neutralisation en raison de la formation de chlorure de sodium, qui peut être toxique pour le bacille de Koch.

Les échantillons doivent être conservés au réfrigérateur et protégés de la lumière lorsqu'ils ne sont pas traités.

Référence

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2. Laboratoires Britannia. 2017. Milieu Löwenstein-Jensen. Disponible sur: britanialab.com.
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4. «Milieu Löwenstein-Jensen». Wikipedia, l'encyclopédie libre. 20 novembre 2018, 15:15 UTC. 24 avril 2019, 18:34. wikipedia.org
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