IMMUNOFLUORESCENCE: JUSTIFICATION, PROTOCOLE ET APPLICATIONS - LA BIOLOGIE - 2025

L' immunofluorescence est une technique puissante d'immunocoloration utilisant des anticorps liés de manière covalente à des molécules fluorescentes pour identifier des cibles spécifiques dans des échantillons cellulaires fixés sur un support solide.

Cette technique implique une observation microscopique à spécificité immunologique, permettant d'observer des cellules vivantes ou mortes pouvant présenter de minuscules quantités d'antigènes. Il est largement utilisé à la fois dans le domaine de la recherche et dans le diagnostic clinique de diverses pathologies.

Immunomarquage des filaments d'actine dans les cellules de cardiomyocytes (Source: Ps1415 via Wikimedia Commons)

Cette technique, principalement qualitative (avec quelques variantes quantitatives), concerne spécifiquement la visualisation d'un échantillon par le signal produit d'un fluorophore, qui est une molécule fluorescente liée à un anticorps et qui est capable d'être excitée à une certaine longueur d'onde.

Dans le contexte cellulaire, il est très utile d'étudier la présence / absence et la localisation subcellulaire des protéines. La technique a été initialement utilisée en milieu clinique pour le diagnostic de virus tels que la grippe et par la suite pour de nombreuses autres maladies infectieuses.

C'est une technique très sensible, et avec le matériel de microscopie approprié, elle peut avoir une très bonne résolution. Il nécessite, pour son observation, l'utilisation de microscopes confocaux ou à épifluorescence.

Cependant, bien que très populaire, il peut présenter des problèmes importants en ce qui concerne l'obtention de fluorescence non spécifique qui génère un certain «bruit» de fond, ce qui limite souvent la lecture adéquate des résultats.

Base

L'immunofluorescence est basée sur l'exploitation du phénomène biologique de la réaction d'interaction entre un anticorps et un antigène. Cela concerne spécifiquement la visualisation ou la détection de cette réaction en excitant des molécules fluorescentes à une longueur d'onde spécifique.

Un anticorps est une protéine d'immunoglobuline sécrétée par les cellules B actives, qui est spécifiquement générée contre un antigène, à laquelle elle peut se lier avec une affinité et une spécificité élevées. L'immunofluorescence utilise des immunoglobulines IgG, qui se trouvent solubles dans le sérum sanguin.

Les anticorps sont des molécules jusqu'à 950 kDa constituées de deux chaînes peptidiques courtes (légères) et deux longues (lourdes) en forme de «Y». Les chaînes légères et lourdes sont toutes deux divisées en deux domaines: une variable, capable de reconnaître l'antigène, et l'autre constante ou conservée, caractéristique de chaque espèce.

Les antigènes sont fonctionnellement définis comme des molécules qui peuvent être reconnues par un anticorps et sont, pour la plupart, des protéines. Lorsqu'un animal est exposé à un antigène, les lymphocytes du système immunitaire sont activés, produisant des anticorps spécifiques contre lui et qui fonctionnent comme un système de défense.

Un antigène, tel qu'une protéine, par exemple, peut avoir plus d'un épitope ou site de reconnaissance par un anticorps, ainsi le sérum de l'animal exposé à un antigène peut avoir des anticorps polyclonaux contre différentes régions de la même protéine.

L'immunofluorescence exploite alors la capacité d'un animal à produire des anticorps polyclonaux contre un antigène spécifique afin de le purifier et de l'utiliser ensuite pour la détection du même antigène dans d'autres contextes.

Parmi les colorants ou molécules fluorescents les plus utilisés pour certaines techniques d'immunofluorescence, on trouve l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), l'isothiocyanate de tétraméthylrhodamine-5 et 6 (TRITC), de nombreuses cyanines telles que Cy2, Cy3, Cy5 et Cy7 et des colorants appelés Alexa Fluor®, comme l'Alexa Fluor®448.

Protocole

Le protocole d'immunofluorescence varie en fonction de nombreux facteurs, cependant, en termes généraux, il englobe une séquence linéaire d'étapes consistant en:

• Préparation des plaques et des cellules
• Fixation des échantillons
• Perméabilisation
• Blocage
• Immunocoloration ou immunocoloration
• Montage et observation

-Préparation

Des échantillons

La préparation des échantillons dépendra de leur nature et du type d'expérience à réaliser. Le cas le plus simple, qui implique l'utilisation de cellules en suspension, sera expliqué ci-dessous.

Les cellules en suspension, c'est-à-dire dans un milieu de culture liquide, doivent d'abord en être séparées par centrifugation puis doivent être lavées avec une solution tampon ou «tampon» isosmotique, qui préserve leur intégrité.

Normalement, un tampon phosphate-solution saline connu sous le nom de PBS est utilisé, dans lequel les cellules sont remises en suspension et ce mélange est à nouveau centrifugé pour obtenir les cellules exemptes du milieu de culture, qui peut contenir des substances interférentes.

Des lames

Les lames utilisées pour l'observation microscopique, où les cellules seront ensuite fixées pour les traitements en aval correspondants, doivent également être soigneusement préparées.

Celles-ci sont recouvertes ou "sensibilisées" avec une solution de poly-lysine, un polymère synthétique qui agira comme une "colle moléculaire" entre les cellules et le support solide, grâce à l'interaction électrostatique entre les charges positives de leurs groupements amino et le charges négatives sur les protéines qui recouvrent les cellules.

Fixation des échantillons

Ce processus consiste à immobiliser les protéines présentes à l'intérieur de la cellule afin de conserver leur localisation spatiale intacte. Les molécules utilisées doivent être capables de traverser tous les types de membranes cellulaires et de former des réseaux avec les protéines covalentes.

Le formaldéhyde et le paraformaldéhyde, le glutaraldéhyde et même le méthanol sont largement utilisés, avec lesquels des échantillons cellulaires sont incubés pendant un certain temps puis lavés avec une solution tampon isosmotique.

Après fixation des cellules, celles-ci continuent d'être fixées sur les feuilles préalablement sensibilisées à la poly-lysine.

Perméabilisation

Selon le type de test effectué, il sera nécessaire de perméabiliser les cellules à l'étude ou non. Si l'on cherche à connaître l'emplacement, la présence ou l'absence d'une certaine protéine à la surface cellulaire, la perméabilisation ne sera pas nécessaire.

En revanche, si vous souhaitez connaître l'emplacement d'une protéine à l'intérieur de la cellule, la perméabilisation est essentielle et consistera à incuber les échantillons avec du Triton X-100, un détergent capable de perméabiliser les membranes cellulaires.

Blocage

Le blocage est une étape fondamentale de toutes les techniques immunologiques. A ce stade de la procédure, le blocage consiste à recouvrir, sur les feuilles sensibilisées, tous les sites par des molécules de poly-lysine auxquelles les cellules n'ont pas adhéré. Autrement dit, il empêche toute union non spécifique.

Normalement, des solutions avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) dans du tampon PBS sont utilisées pour le blocage et les meilleurs résultats sont obtenus plus le temps d'incubation avec cette solution est long. Après chaque étape, y compris le blocage, il est nécessaire de laver la solution restante.

Immunocoloration ou immunocoloration

La procédure d'immunocoloration ou d'immunocoloration dépendra principalement du fait qu'il s'agit d'une immunofluorescence directe ou indirecte (voir ci-dessous).

S'il s'agit d'une immunofluorescence primaire ou directe, les échantillons seront incubés avec les anticorps souhaités, qui doivent être couplés aux colorants fluorescents. La procédure d'incubation consiste à faire une dilution de l'anticorps dans une solution qui contiendra également de la BSA mais dans une proportion plus faible.

Lorsqu'il s'agit d'une immunofluorescence secondaire ou indirecte, deux incubations consécutives doivent être effectuées. D'abord avec les anticorps désirés, puis avec les anticorps capables de détecter les régions constantes des immunoglobulines primaires. Ce sont ces anticorps secondaires qui sont liés de manière covalente aux fluorophores.

La technique est très polyvalente, permettant le marquage simultané de plus d'un antigène par échantillon, à condition qu'il y ait des anticorps primaires couplés à différents fluorophores, dans le cas d'une immunofluorescence directe.

Pour un marquage simultané en immunofluorescence indirecte, il est nécessaire de s'assurer que chaque anticorps primaire est produit chez un animal différent, ainsi que chaque anticorps secondaire est couplé à un fluorophore différent.

Tout comme le blocage, l'incubation avec des anticorps donne de meilleurs résultats plus la durée est longue. Après chaque étape, il est nécessaire de laver l'excès d'anticorps qui ne se sont pas liés aux échantillons et dans l'immunofluorescence secondaire, il est nécessaire de bloquer avant d'ajouter l'anticorps secondaire.

Certaines techniques utilisent d'autres colorations qui ne sont pas liées à l'immunocoloration, telles que la coloration de l'ADN nucléaire avec le fluorophore DAPI.

Montage et observation

Pendant le temps d'incubation final avec les fluorophores, il est nécessaire que les échantillons restent dans l'obscurité. Pour l'observation au microscope, il est courant d'utiliser certaines substances pour préserver la fluorescence des fluorophores couplés aux anticorps.

Les types

Résumé graphique de l'immunofluorescence directe et indirecte (Source: Westhayl618 via Wikimedia Commons)

Immunofluorescence directe ou primaire

Il s'agit de la détection d'antigènes grâce à l'utilisation d'anticorps fluorescents. Le principal avantage de l'utilisation de cette technique est sa rapidité, cependant, de nombreux cas de liaison non spécifique peuvent se produire dans le processus, en particulier lors de l'étude des sérums humains, car ils sont riches en anticorps très hétérogènes.

Immunofluorescence indirecte ou secondaire

Elle est également connue sous le nom de technique «sandwich» et cela implique le développement de la technique en deux étapes. Le premier concerne l'utilisation d'un anticorps non fluorescent et sa liaison à l'antigène d'intérêt.

Contre la région constante de ce premier anticorps (qui servira maintenant d'antigène), on utilise un second anticorps capable de le reconnaître, qui est associé à une molécule fluorescente.

L'apparition d'un signal fluorescent sera le résultat d'une reconnaissance spécifique entre le premier anticorps non fluorescent et l'antigène d'intérêt; la présence de ce premier anticorps conditionne celle du second, qui est marqué et grâce auquel la présence ou l'absence de l'antigène peut être déterminée.

Bien qu'elle soit une technique beaucoup plus longue que l'immunofluorescence directe (puisqu'elle comprend une étape d'incubation supplémentaire), cette technique n'implique pas la conception d'un anticorps fluorescent pour chaque antigène étudié, ce qui se traduit, en termes économiques, plus viable.

De plus, il s'agit d'une technique plus sensible en termes d'amplification du signal, puisque plus d'un anticorps secondaire peut se lier à la région constante de l'anticorps primaire, amplifiant ainsi l'intensité du signal fluorescent.

Applications

Comme on l'a peut-être noté précédemment, l'immunofluorescence est une technique extrêmement polyvalente, qui a été utilisée de nombreuses manières dans les domaines scientifique et clinique. Il peut être utilisé pour répondre à des questions écologiques, génétiques et physiologiques concernant de nombreux organismes.

Parmi les applications cliniques, il est utilisé pour le diagnostic direct de certaines maladies dermatologiques, soit par immunofluorescence directe soit indirecte sur le tissu épithélial des patients étudiés.

Des techniques d'immunofluorescence sont disponibles dans des organismes unicellulaires tels que la levure pour visualiser les microtubules intranucléaires et cytoplasmiques, l'actine et les protéines associées, les filaments de 10 nm et d'autres constituants du cytoplasme, de la membrane et des parois cellulaires.

Références

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