ENZYMES DE RESTRICTION: FONCTIONS, TYPES ET EXEMPLES - LA BIOLOGIE - 2025

Les enzymes de restriction sont des endonucléases employées par certaines archées et bactéries pour inhiber ou "restreindre" la propagation des virus à l'intérieur. Ils sont particulièrement fréquents chez les bactéries et font partie de leur système de défense contre l'ADN étranger connu sous le nom de système de restriction / modification.

Ces enzymes catalysent le clivage de l'ADN double bande à des endroits spécifiques, de manière reproductible et sans utilisation d'énergie supplémentaire. La plupart nécessitent la présence de cofacteurs tels que le magnésium ou d'autres cations divalents, bien que certains nécessitent également de l'ATP ou de la S-adénosyl méthionine.

Schéma de réaction enzymatique de restriction HindIII (Source: Helixitta via Wikimedia Commons)

Les endonucléases de restriction ont été découvertes en 1978 par Daniel Nathans, Arber Werner et Hamilton Smith, qui ont reçu le prix Nobel de médecine pour leur découverte. Leur nom dérive généralement de l'organisme où ils sont observés pour la première fois.

Ces enzymes sont largement utilisées dans le développement de méthodes de clonage d'ADN et d'autres stratégies de biologie moléculaire et de génie génétique. Leurs caractéristiques spécifiques de reconnaissance de séquence et leur capacité à couper des séquences à proximité des sites de reconnaissance en font de puissants outils d'expérimentation génétique.

Les fragments générés par des enzymes de restriction qui ont agi sur une molécule d'ADN particulière peuvent être utilisés pour recréer une «carte» de la molécule d'origine en utilisant des informations sur les sites où l'enzyme coupe l'ADN.

Certaines enzymes de restriction peuvent avoir le même site de reconnaissance sur l'ADN, mais elles ne le coupent pas nécessairement de la même manière. Ainsi, il existe des enzymes qui coupent en laissant les extrémités franches et des enzymes qui coupent en laissant des extrémités cohésives, qui ont différentes applications en biologie moléculaire.

Actuellement, il existe des centaines d'enzymes de restriction disponibles dans le commerce, proposées par différentes maisons commerciales; Ces enzymes fonctionnent comme des ciseaux moléculaires «personnalisés» à des fins différentes.

Caractéristiques

Les enzymes de restriction remplissent la fonction opposée des polymérases, puisqu'elles hydrolysent ou rompent la liaison ester au sein de la liaison phosphodiester entre les nucléotides adjacents dans une chaîne nucléotidique.

En biologie moléculaire et en génie génétique, ils sont des outils largement utilisés pour la construction de vecteurs d'expression et de clonage, ainsi que pour l'identification de séquences spécifiques. Ils sont également utiles pour la construction de génomes recombinants et ont un grand potentiel biotechnologique.

Les progrès récents de la thérapie génique utilisent actuellement des enzymes de restriction pour l'introduction de gènes particuliers dans des vecteurs qui sont des véhicules pour le transport de ces gènes dans des cellules vivantes, et qui ont probablement la capacité de s'insérer dans le génome cellulaire pour fonctionner. changements permanents.

Mécanisme d'action

Les enzymes de restriction peuvent catalyser le clivage de l'ADN à double bande, bien que certaines soient capables de reconnaître des séquences d'ADN à une seule bande et même de l'ARN. La découpe intervient après la reconnaissance des séquences.

Le mécanisme d'action consiste en l'hydrolyse de la liaison phosphodiester entre un groupe phosphate et un désoxyribose dans le squelette de chaque brin d'ADN. De nombreuses enzymes sont capables de couper au même site qu'elles reconnaissent, tandis que d'autres coupent entre 5 et 9 paires de bases avant ou après.

Ces enzymes coupent normalement à l'extrémité 5 'du groupe phosphate, donnant naissance à des fragments d'ADN avec une extrémité 5' phosphoryle et une extrémité hydroxyle terminale 3 '.

Puisque les protéines n'entrent pas en contact direct avec le site de reconnaissance dans l'ADN, elles doivent être transloquées successivement jusqu'à ce que le site spécifique soit atteint, peut-être au moyen de mécanismes de "glissement" sur le brin d'ADN.

Pendant le clivage enzymatique, la liaison phosphodiester de chacun des brins d'ADN est positionnée dans l'un des sites actifs des enzymes de restriction. Lorsque l'enzyme quitte le site de reconnaissance et de clivage, elle le fait par des associations transitoires non spécifiques.

Les types

Cinq types d'enzymes de restriction sont actuellement connus. Voici une brève description de chacun d'eux:

Enzymes de restriction de type I

Ces enzymes sont de grandes protéines pentamères avec trois sous-unités, une pour la restriction, une pour la méthylation et une pour la reconnaissance de séquence dans l'ADN. Ces endonucléases sont des protéines multifonctionnelles capables de catalyser des réactions de restriction et de modification, elles ont une activité ATPase et également une ADN topoisomérase.

Les enzymes de ce type ont été les premières endonucléases à être découvertes, elles ont été purifiées pour la première fois dans les années 1960 et ont été étudiées en profondeur depuis lors.

Les enzymes de type I ne sont pas largement utilisées comme outil biotechnologique, car le site de clivage peut être à une distance variable allant jusqu'à 1000 paires de bases du site de reconnaissance, ce qui les rend peu fiables en termes de reproductibilité expérimentale.

Enzymes de restriction de type II

Ce sont des enzymes composées d'homodimères ou de tétramères qui coupent l'ADN à des sites définis entre 4 et 8 pb de longueur. Ces sites de clivage sont typiquement palindromiques, c'est-à-dire qu'ils reconnaissent des séquences qui sont lues de la même manière dans les deux sens.

De nombreuses enzymes de restriction de type II présentes dans les bactéries coupent l'ADN lorsqu'elles reconnaissent son caractère étranger, car il ne présente pas les modifications typiques que son propre ADN devrait avoir.

Ce sont les enzymes de restriction les plus simples car elles ne nécessitent aucun cofacteur autre que le magnésium (Mg +) pour reconnaître et couper les séquences d'ADN.

La précision des enzymes de restriction de type II dans la reconnaissance et la découpe de séquences simples dans l'ADN à des positions précises en fait l'une des plus largement utilisées et indispensables dans la plupart des branches de la biologie moléculaire.

Dans le groupe des enzymes de restriction de type II, il existe plusieurs sous-classes classées en fonction de certaines propriétés qui sont uniques à chacune. La classification de ces enzymes se fait en ajoutant des lettres de l'alphabet, de A à Z suivant le nom de l'enzyme.

Certaines des sous-classes les plus connues pour leur utilité sont:

Sous-classe IIA

Ce sont des dimères de différentes sous-unités. Ils reconnaissent les séquences asymétriques et sont utilisés comme précurseurs idéaux pour la génération d'enzymes de coupe.

Sous-classe IIB

Ils sont constitués d'un ou plusieurs dimères et coupent l'ADN des deux côtés de la séquence de reconnaissance. Ils coupent les deux brins d'ADN à un intervalle de paires de bases avant le site de reconnaissance.

Sous-classe IIC

Les enzymes de ce type sont des polypeptides ayant des fonctions de division et de modification des brins d'ADN. Ces enzymes coupent les deux brins de manière asymétrique.

Sous-classe IIE

Les enzymes de cette sous-classe sont les plus utilisées en génie génétique. Ils ont un site catalytique et nécessitent généralement un effecteur allostérique. Ces enzymes doivent interagir avec deux copies de leur séquence de reconnaissance pour effectuer un clivage efficace. Dans cette sous-classe se trouvent les enzymes EcoRII et EcoRI.

Enzymes de restriction de type III

Les endonucléases de restriction de type III sont composées de seulement deux sous-unités, l'une est responsable de la reconnaissance et de la modification de l'ADN, tandis que l'autre est responsable du clivage de la séquence.

Ces enzymes nécessitent deux cofacteurs pour leur fonction: l'ATP et le magnésium. Les enzymes de restriction de ce type possèdent deux sites de reconnaissance asymétriques, transloquent l'ADN de manière dépendante de l'ATP et le coupent entre 20 et 30 pb à côté du site de reconnaissance.

Enzymes de restriction de type IV

Les enzymes de type IV sont faciles à identifier car elles coupent l'ADN avec des marques de méthylation, elles sont constituées de plusieurs sous-unités différentes qui sont responsables de la reconnaissance et de la coupe de la séquence d'ADN. Ces enzymes utilisent le GTP et le magnésium divalent comme cofacteurs.

Les sites de clivage spécifiques comprennent des brins nucléotidiques avec des résidus cytosine méthylés ou hydroxyméthylés sur un ou les deux brins d'acides nucléiques.

Enzymes de restriction de type V

Cette classification regroupe les enzymes de type CRISPER-Cas, qui identifient et coupent des séquences d'ADN spécifiques d'organismes envahisseurs. Les enzymes Cas utilisent un brin d'ARN guide synthétisé par CRISPER pour reconnaître et attaquer les organismes envahisseurs.

Les enzymes classées en tant que type V sont des polypeptides structurés par des enzymes de type I, II et II. Ils peuvent couper des sections de l'ADN de presque tous les organismes et avec une large gamme de longueurs. Leur flexibilité et leur facilité d'utilisation font de ces enzymes l'un des outils les plus utilisés aujourd'hui en génie génétique, avec les enzymes de type II.

Exemples

Des enzymes de restriction ont été utilisées pour la détection des polymorphismes de l'ADN, en particulier dans les études de génétique des populations et les études évolutives utilisant l'ADN mitochondrial, afin d'obtenir des informations sur les taux de substitutions nucléotidiques.

Actuellement, les vecteurs utilisés pour la transformation de bactéries à des fins diverses possèdent des sites de multiclonage où se trouvent des sites de reconnaissance pour plusieurs enzymes de restriction.

Parmi ces enzymes, les plus populaires sont EcoRI, II, III, IV et V, obtenus et décrits pour la première fois à partir d'E. Coli; HindIII de H. influenzae et BamHI de B. amyloliquefaciens.

Références

1. Bickle, TA et Kruger, DH (1993). Biologie de la restriction de l'ADN. Examens microbiologiques, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA et Horvath, P. (2007). CRISPR fournit une résistance acquise contre les virus chez les procaryotes. Science, 315 (mars), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). La perspective moléculaire: les endonucléases de restriction. Fondamentaux des cellules souches de la médecine du cancer, 20, 190–191.
4. Halford, SE (2001). Sauter, sauter et boucler par des enzymes de restriction. Transactions de la société biochimique, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Maintien de l'identité des espèces et contrôle de la spéciation des bactéries: une nouvelle fonction pour les systèmes de restriction / modification? Gène, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E. et Kilpatrick, S. (2018). Lewin's Genes XII (12 éd.). Burlington, Massachusetts: Jones et Bartlett Learning.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… Elle, Q. (2015). Exploitation des systèmes CRISPR-Cas de type I et de type III pour l'édition du génome. Recherche sur les acides nucléiques, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA et Wilson, GG (2013). Enzymes de restriction de type I et leurs proches. Recherche sur les acides nucléiques, 1–25.
9. Nathans, D. et Smith, HO (1975). Endonucléases de restriction dans l'analyse et la restructuration des molécules d'ADN. Annu. Rev. Biochem., 273-293.
10. Nei, M. et Tajima, F. (1981). Polymorphisme de l'ADN détectable par les endonucléases de restriction. Génétique, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., et Wende, W. (2005). Endonucléases de restriction de type II des sciences de la vie cellulaires et moléculaires: structure et mécanisme. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Comment les enzymes de restriction sont devenues les bêtes de somme de la biologie moléculaire. PNAS, 102 (17), 5905-5908.
13. Roberts, RJ et Murray, K. (1976). Endonucléases de restriction. Critical Reviews in Biochemistry, (novembre), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Homing endonucléase structure et fonction. Examens trimestriels de biophysique, 1–47.
15. Tock, MR et Dryden, DTF (2005). La biologie de la restriction et de l'anti-restriction. Opinion actuelle en microbiologie, 8, 466–472.
16. Wilson, GG et Murray, NE (1991). Systèmes de restriction et de modification. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
17. Wu, Z. et Mou, K. (2016). Informations génomiques sur la virulence de Campylobacter jejuni et la génétique des populations. Infec. Dis. Transl. Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Structure et mécanisme des endonucléases de restriction multifonctionnelles. Annu. Rev. Biochem., 50, 285-315.