TAMPON PHOSPHATE (PBS): JUSTIFICATION, PRÉPARATION ET UTILISATIONS - LA BIOLOGIE - 2024

Le tampon phosphate, phosphate salin tamponné ou BPS est un tampon isotonique, dont la fonction est de maintenir le pH et la pression osmotique au plus près de l'environnement biologique naturel (physiologique). L'acronyme PBS signifie solution saline tamponnée au phosphate.

Le pH et l'osmolarité sont deux aspects très importants qui doivent être contrôlés dans certains protocoles de laboratoire. Dans le cas du pH, il est essentiel qu'il soit contrôlé, notamment dans les réactions biochimiques, car celles-ci peuvent varier ou ne pas être réalisées si les réactifs sont à un pH inapproprié.

Une solution saline tamponnée au phosphate PBS à deux pH différents. Source: Pixinio.com

Parallèlement, le contrôle de l'osmolarité est essentiel surtout lorsqu'on travaille avec des cellules vivantes, car les membranes plasmiques des cellules réagissent en fonction de la concentration de solutés dans lesquelles elles se trouvent.

Si les cellules sont transférées dans un milieu hypertonique, elles se déshydrateront, car le gradient d'eau sera transporté du côté où il y a une concentration plus élevée de solutés. Si, au contraire, les cellules sont placées dans un milieu hypotonique, les cellules absorberont du liquide jusqu'à ce qu'elles soient lysées.

C'est pourquoi le tampon PBS est utilisé pour les protocoles de laboratoire qui nécessitent le maintien des cellules in vitro, de cette manière les cellules ne seront pas endommagées.

Le PBS est composé d'une combinaison de sels, tels que le chlorure de sodium, le phosphate de sodium, le chlorure de potassium et le phosphate de potassium. La composition du PBS peut varier en fonction du protocole.

Base

Fondamentalement, la fonction du tampon phosphate salin est de maintenir un pH physiologique constant avec une concentration d'électrolyte similaire à celle trouvée à l'intérieur du corps.

Dans cet environnement, les cellules sont capables de rester stables, car les conditions physiologiques sont simulées autant que possible.

D'autres composés peuvent être ajoutés à la formulation originale de PBS si nécessaire, par exemple l'ajout d'EDTA au tampon est utile pour laver les globules rouges dans le test d'incompatibilité croisée.

L'EDTA empêche la fraction de complément C1 présente dans le sérum d'être clivée et lysée vers les globules rouges, c'est-à-dire qu'elle évite les faux résultats d'incompatibilité. De plus, l'EDTA aide à dissocier les cellules.

préparation

La quantité de sels qui doit être pesée pour la préparation de la solution saline tamponnée au phosphate PBS dépendra de la quantité à préparer:

-Solution stock saline tamponnée au phosphate (10X PBS)

Pour un litre de solution:

Peser:

80,6 g de NaCl,

2,2 g de KCl, 11,5 g de Na ₂ HPO ₄, 2,0 g KH ₂ HPO ₄

Technique de préparation

Placer les sels lourds dans un bécher, ajouter suffisamment d'eau (80%) et mélanger sur la plaque d'agitation avec un barreau magnétique jusqu'à ce que les sels soient dissous.

Préparation du PBS à l'aide d'une plaque d'agitation avec un barreau magnétique. Source: Utilisateur: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtrez pour éliminer les particules non dissoutes. Utilisez des filtres avec des pores de 0,45 µm. Autoclave et distribuer aseptiquement dans une hotte à flux laminaire dans des bocaux en verre avec couvercles.

La solution 10X (concentrée) n'ajuste pas le pH. L'ajustement est effectué une fois dilué à la concentration du tampon PBS 1X, (dilution 1:10).

-Buffer phosphate salin (1X PBS)

Le PBS 1X peut être préparé directement, en pesant les quantités correspondantes de chaque sel, ou il peut être préparé en diluant la solution mère (1:10) avec de l'eau distillée stérile.

-Pour préparer directement un litre de solution saline tamponnée au phosphate 1X PBS, peser:

8,06 g de NaCl, 0,22 g de KCl, 1,15 g de Na ₂ HPO ₄, 0,20 g de KH ₂ HPO ₄

Technique de préparation

Procédez comme expliqué dans la solution concentrée. Par la suite, le pH doit être ajusté. Pour ce faire, mesurez le pH et, en fonction du résultat, utilisez de l'acide (HCl) ou une base (NaOH) pour abaisser ou augmenter le pH respectivement si nécessaire, jusqu'à ce qu'il soit de 7,4.

L'acide ou la base sont ajoutés goutte à goutte tout en surveillant le pH de la solution à l'aide d'un pH-mètre. Filtrer, autoclave et répartir aseptiquement dans des tubes ou des bocaux coniques selon les besoins.

-Pour préparer 1X PBS à partir de la solution mère 10X:

Faites une dilution à 1:10. Par exemple, pour préparer 1 litre de PBS 1X, mesurer 100 ml de la solution mère et ajouter 700 ml d'eau distillée stérile. Ajustez le pH et remplissez la quantité d'eau jusqu'à 1000 ml.

Le tampon PBS préparé est incolore et limpide.

Le PBS quotidien peut être conservé à température ambiante et le reste au réfrigérateur.

Solutions pour l'ajustement du pH

HCl

Pour 100 ml de HCL 1 molaire (acide chlorhydrique).

Mesurez 91 ml d'eau distillée et placez-le dans un bécher de 250 ml.

Mesurez 8,62 ml de HCl concentré et ajoutez-le lentement dans le bécher contenant l'eau (ne jamais faire l'inverse). Prendre les mesures de biosécurité appropriées lors de la manipulation d'acides forts (substance hautement corrosive).

Mélanger pendant 5 minutes de préférence en utilisant une plaque d'agitation avec un barreau magnétique à l'intérieur du verre. Transférer dans un flacon de 100 ml et compléter à 100 ml avec H ₂ O distillée.

NaOH

Pour 100 ml de NaOH (hydroxyde de sodium) 10 molaire.

Mesurez 40 ml d'eau distillée et placez-le dans un bécher de 250 ml. Mesurer 40 g de NaOH et ajouter à l'eau. Mélanger à l'aide d'une plaque d'agitation avec une barre magnétique à l'intérieur du verre.

Transférer dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter au trait avec de l'eau distillée. Respectez les réglementations de biosécurité, car cette réaction est exothermique (elle dégage de l'énergie sous forme de chaleur).

Si vous souhaitez préparer d'autres quantités de solution saline de phosphate, vous pouvez consulter le tableau suivant:

Source: «Laboratoire de génomique virale et humaine, École de médecine UASLP»

Applications

Il est principalement utilisé dans les laboratoires de biologie cellulaire, d'immunologie, d'immunohistochimie, de bactériologie, de virologie et de recherche.

Il est idéal pour réaliser des lavages cellulaires par centrifugeuses (globules rouges), des lavages de monocouches cellulaires, dans des techniques d'ellipsométrie spectroscopique, dans la quantification de biofilms bactériens, dans l'entretien de cultures cellulaires pour virus, comme solution de lavage dans la technique d'immunofluorescence indirecte et dans les techniques de caractérisation des anticorps monoclonaux.

Il est également utilisé pour transporter des cellules ou des tissus, comme diluant pour le comptage cellulaire, la préparation d'enzymes cellulaires (trypsine), comme diluant pour la méthode de dessiccation des biomolécules et pour préparer d'autres réactifs.

D'autre part, Martin et al.En 2006 ont démontré que le PBS est utile dans les laboratoires de médecine légale, en particulier dans la récupération de spermatozoïdes à partir de frottis vaginaux, ou dans la récupération de cellules vaginales à partir de frottis péniens. De cette façon, il peut être établi s'il y a eu une relation sexuelle.

Limites

-Certains tampons PBS contiennent une substance appelée azide de sodium comme conservateur. Ce composé peut générer des substances explosives s'il entre en contact avec du plomb ou du cuivre. Pour cette raison, des précautions particulières doivent être prises lors de la mise au rebut de ce réactif dans le drain. S'il est jeté de cette manière, il faut ajouter de l'eau en abondance pour le diluer au maximum.

-Le zinc ne doit pas être ajouté au tampon phosphate, car il provoque la précipitation de certains sels.

-Wangen et ses collaborateurs en 2018 ont déterminé que l'utilisation du PBS n'était pas adaptée au lavage des cellules primaires de leucémie myéloïde aiguë (LMA) extraites du sang périphérique, en raison du fait que de nombreuses cellules sont perdues par lyse, avec une forte diminution du matériel protéine.

Par conséquent, ils ont déterminé que les cellules AML primaires ne devraient pas être lavées avec du PBS après stockage dans de l'azote liquide.

Références

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