GÉLOSE TSI: JUSTIFICATION, PRÉPARATION ET UTILISATIONS - LA BIOLOGIE - 2025

La gélose TSI ou gélose triple sucre fer est un milieu solide qui sert de test biochimique pour guider l'identification initiale des bacilles Gram négatifs. Il est basé sur la mise en évidence de la fermentation des sucres présents et de la production de sulfure d'hydrogène et de gaz.

Sa composition et sa base sont très similaires au test de fer de Kligler, à la différence que ce dernier ne contient que du glucose et du lactose. Au lieu de cela, comme son nom l'indique, la gélose triple sucre et fer contient trois glucides fermentescibles: le glucose, le lactose et le saccharose.

Images du test TSI avec différents microorganismes A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Source: Witmadrid, de Wikimedia Commons

De plus, le milieu TSI contient quatre dérivés protéiques qui en font une gélose très nutritive: extrait de levure, extrait de viande, peptone et protéose peptone. Il contient également du sulfate d'ammonium ferreux, du thiosulfate de sodium, du chlorure de sodium, du rouge de phénol et de l'agar.

L'incapacité d'un microorganisme à fermenter le glucose présent dans le milieu l'exclut immédiatement d'appartenir à la famille des Enterobacteriaceae. Par conséquent, ce test est essentiel pour décider de la voie d'identification à suivre pour déterminer le genre et l'espèce.

Chaque laboratoire décide de travailler avec la gélose TSI ou avec la gélose au fer Kligler.

Base

Chacun des composés remplit une fonction au sein du milieu.

Chlorure de sodium et agar

Le chlorure de sodium est nécessaire pour maintenir l'équilibre osmotique du milieu. Alors que l'agar donne la consistance solide.

Indicateur de pH (rouge phénol)

Le pH du milieu préparé est équilibré à 7,3 et l'indicateur de pH (rouge phénol) devient jaune en dessous de 6,8. Cela signifie que de petites quantités d'acides produites par la fermentation des sucres feront passer le milieu du rouge-orange au jaune.

Si aucune fermentation ne se produit, il y aura alcalinisation du milieu par l'utilisation de peptones, passant du rouge-orange au rouge intense.

Dérivés protéiques (extrait de levure, extrait de viande, peptone et protéose peptone)

Lorsque les bactéries métabolisent les protéines présentes dans la gélose TSI, des amines sont produites qui alcalinisent le milieu (principalement au niveau du biseau), car la réaction nécessite de l'oxygène. Les amines rendent la lunette rouge vif.

Mais cela dépendra de la capacité des bactéries à fermenter ou non les glucides.

Fermentation des glucides (glucose, lactose et saccharose)

L'étude de la fermentation des sucres peut donner plusieurs images et chacune est interprétée différemment. L'interprétation du test divise les micro-organismes en 3 catégories: les non-fermenteurs de glucose, les non-fermenteurs de lactose et les fermenteurs de lactose / saccharose.

Il est à noter que la quantité de glucose dans le milieu est limitée, tandis que la concentration de lactose et de saccharose est 10 fois plus élevée.

Les bactéries de la famille des entérobactéries et d'autres micro-organismes fermentant le glucose commenceront à fermenter ce sucre car il s'agit du glucide le plus simple pour l'énergie.

D'autre part, le lactose et le saccharose sont des glucides complexes qui doivent être décomposés et convertis en glucose pour entrer dans le cycle Embden-Meyerhof.

-Micro-organismes ne fermentant pas le glucose

Lorsque le microorganisme inoculé est incapable de fermenter le glucose, il sera encore moins capable de fermenter d'autres glucides. Par conséquent, aucun acide ne se forme ici, mais il y a formation d'amines dans le biseau par l'utilisation de peptones.

Dans ce cas, la lunette vire au rouge plus fort et le fond du tube peut rester inchangé ou il peut également être alcalinisé, laissant tout le tube rouge.

Interprétation: K / K signifie biseau alcalin / fond alcalin ou neutre

Dans l'image au début de l'article, voir l'image du tube D.

Ce résultat indique que le microorganisme n'appartient pas à la famille des Enterobacteriaceae.

-Micro-organismes ne fermentant pas le lactose / saccharose

Si les bactéries sont capables de fermenter le glucose mais pas le lactose ou le saccharose, ce qui suit se produira:

Les bactéries vont consommer tout le glucose présent après environ 6 à 8 heures, pouvant acidifier à la fois le biseau et le bloc; c'est-à-dire que l'agar aura complètement viré au jaune. Mais lorsque le glucose est épuisé et que le lactose et le saccharose ne peuvent pas être utilisés, les bactéries commencent le métabolisme des protéines.

Cette réaction a besoin d'oxygène, donc la dégradation des peptones se produit en surface (biseau). Les amines produites alcalinisent la lunette en passant du jaune au rouge. Cette réaction est mise en évidence après 18 à 24 heures d'incubation.

Interprétation: K / A signifie biseau alcalin et bourre d'acide.

Dans l'image au début de l'article, voir l'image du tube B.

-Micro-organismes fermentant le lactose / saccharose

Les microorganismes capables de fermenter le lactose et le saccharose peuvent évidemment fermenter le glucose. Après épuisement de la quantité minimale de glucose présente dans le milieu, le pyruvate formé commence à se métaboliser pour former des acides à travers le cycle aérobie de Krebs, et dans la période de 8 à 12 heures, tout le milieu sera jaune.

Si la bactérie est capable de décomposer le lactose ou le saccharose, des acides continueront à être produits et, après 18 à 24 heures, tout le tube - biseau et bouchon - continuera à jaunir.

Il est à noter que l'utilisation du glucose s'effectue de deux manières: l'une en aérobie au biseau du tube, et l'autre en anaérobie au fond du tube.

Interprétation: A / A signifie biseau acide / fond acide. Il peut contenir ou non du gaz.

Dans l'image au début de l'article, voir l'image du tube A.

Production de gaz

Certains micro-organismes sont capables de produire du gaz lors de la fermentation des sucres. Le gaz est mis en évidence dans le tube par la pression qu'il exerce à l'intérieur de la gélose. La pression provoque la formation de bulles ou le déplacement de la gélose. Parfois, la formation de gaz peut fracturer le milieu.

Il est important que lors de l'ensemencement du milieu TSI, la ponction soit faite proprement par le centre de la gélose jusqu'à ce qu'elle atteigne le fond. Si la ponction est détournée vers les parois du tube, elle peut provoquer des faux positifs dans la production du gaz, car il s'échappera par le canal mal formé.

La production de gaz, ainsi que les réactions qui se produisent dans le biseau de gélose, ont besoin d'oxygène.Il est donc recommandé de recouvrir le tube d'un bouchon de coton et, si un couvercle en bakélite est utilisé, il ne doit pas être complètement étanche.

La production de gaz est signalée comme positive (+) ou négative (-).

Modèles de formation de gaz. Source: Schéma réalisé par MSc. Marielsa Gil. Source de l'image: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, via Wikimedia Commons

Thiosulfate de sodium et sulfate d'ammonium ferreux

Les bactéries capables de produire du sulfure d'hydrogène (gaz incolore) absorbent le soufre du thiosulfate de sodium présent dans le milieu. Une fois H ₂ S formé, il réagit avec le sulfate d'ammonium ferreux, produisant du sulfure de fer (précipité noir clairement visible).

La production de H ₂ S est signalée comme positive (+) ou négative (-).

Dans l'image au début de l'article, voir l'image du tube C.

préparation

Peser 62,5 g de milieu de gélose déshydratée triple sucre fer (TSI) et dissoudre dans un litre d'eau distillée.

Chauffer jusqu'à ce que la gélose soit complètement dissoute. Faire bouillir pendant une minute en remuant fréquemment. Répartir 4 ml de milieu dans des tubes à essai 13/100 avec des bouchons en coton.

Stériliser dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes. Retirer de l'autoclave et laisser reposer à un angle. Il faut veiller à ce que la base et le cadre aient la même distance.

A conserver au réfrigérateur entre 2 et 8 ° C. Laissez-le se réchauffer avant de semer la souche bactérienne.

La couleur du milieu déshydraté est beige clair et le milieu préparé est rouge-orange.

Le pH final du milieu préparé est de 7,3 ± 0,2.

Applications

Le test TSI est largement utilisé au niveau des laboratoires de microbiologie. Ce test est essentiel pour guider le type de test qui doit être appliqué afin d'identifier le genre et l'espèce. Sa bonne exécution et son interprétation peuvent économiser du matériel et du travail.

Si le résultat est un TSI K / K et que le test de la cytochrome oxydase est positif, il est connu que des tests doivent être utilisés pour l'identification de bâtonnets Gram négatifs non fermentants, tels que Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, entre autres genres. S'il est oxydase négatif, il est orienté vers les genres Acinetobacter, Stenotrophomonas, etc.

En revanche, si un TSI A / A ou K / A est obtenu et que le test du cytochrome oxydase est négatif, plus les nitrates se réduisent en nitrites, on sera sûr qu'il s'agit d'un microorganisme appartenant à la famille des Enterobacteriaceae. Dans ce cas, la voie d'identification se concentrera sur des tests spécifiques pour ce groupe de bactéries.

En revanche, si une image K / A ou A / A est obtenue et que le test cytochrome oxydase est positif, les tests complémentaires à assembler viseront à l'identification des souches en fermentation n'appartenant pas à la famille des Enterobacteriaceae, telles que: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio et Pasteurella.

Une STI avec du sulfure d'hydrogène, oxydase négative, guidera l'identification des genres suivants de la famille des Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella ou Salmonella.

Une STI avec peu ou modérément de sulfure d'hydrogène dans le biseau alcalin avec un fond alcalin et une oxydase positive guidera l'utilisation de tests pour l'identification de bâtonnets Gram-négatifs non fermentants produisant du H ₂ S, tels que Shewanella putrefaciens.

Enfin, la STI peut être utilisée pour l'étude de la production de sulfure d'hydrogène chez les bacilles à Gram positif, en particulier lorsque Erysipelothrix rhusiopathiae est suspectée.

Semé

Le milieu TSI doit être inoculé avec des colonies pures, isolées en cultures primaires ou sélectives. Si la colonie est prélevée sur des milieux sélectifs qui ont été ensemencés avec des échantillons de flore mixte, il faut prendre soin de ne prélever que de la surface, car des souches viables inhibées dans ce milieu peuvent exister dans la partie inférieure de la colonie.

Par conséquent, la boucle ne doit jamais être refroidie sur un milieu sélectif, puis la colonie est reprise et inoculée avec du milieu TSI.

Le semis se fera avec une boucle droite ou une aiguille. Une crevaison sera faite en veillant à ce qu'elle passe par le centre du milieu jusqu'à atteindre le fond, puis le semis est terminé en inoculant la surface en forme de zigzag. Ne faites pas deux crevaisons.

Incuber à 37 ° C en aérobiose pendant 18 à 24 heures. Interpréter à ce moment, ni avant ni après.

Limites

Le test TSI doit être lu dans les 18 à 24 heures suivant l'incubation. Une lecture avant cette heure peut donner un faux positif pour la fermentation A / A. Alors qu'une lecture après ce temps peut donner lieu à une fausse image négative d'un non-fermenteur, en raison de la consommation de peptones qui alcalinisent le milieu.

Références

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6. Laboratoires BD. Gélose triple sucre et fer (TSI Agar). 2003. Disponible sur: bd.com