La gélose TCBS est un moyen de culture solide très sélective et différentielle, utilisé pour l'isolement et la culture de bactéries du genre Vibrio, en particulier Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus et V. vulnificus comme agents pathogènes majeurs de ce type.
L'acronyme TCBS signifie Thiosulfate Citrate Bile Sucrose. Cette gélose est également connue comme milieu sélectif pour Vibrios. La formule originale a été créée par Nakanishi et plus tard modifiée par Kobayashi.
Milieu TCBS commercial et plaque de gélose TCBS ensemencée avec Vibrio cholerae. Source: photo 1: prise par l'auteur MSc. Marielsa Gil / Photo 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, Inde
Il est composé d'extrait de levure, de peptone de viande, de triptein, de citrate de sodium, de thiosulfate de sodium, de bile de bœuf, de saccharose, de chlorure de sodium, de citrate ferrique, de bleu de bromothymol, de bleu de thymol et d'agar.
Cette composition permet un développement adéquat des espèces de Vibrio à partir d'échantillons d'eau, d'aliments et de matières fécales; à l'exception de Vibrio hollisae, qui ne pousse pas sur ce milieu. De plus, le milieu TCBS est capable d'inhiber la croissance d'autres bactéries d'accompagnement, en particulier les coliformes.
En raison des graves problèmes gastro-intestinaux et extra-intestinaux produits par certaines espèces du genre Vibrio, son diagnostic est très important. Les humains sont principalement infectés en mangeant des aliments crus ou mal cuits de la mer ou des eaux polluées, mais aussi par l'infection des plaies.
Pour cette raison, les laboratoires cliniques doivent inclure la gélose TCBS dans l'étude de culture de selles d'échantillons de selles liquides, en particulier avec l'apparition d'eau de riz. Surtout si le patient déclare avoir été en contact avec de l'eau de mer ou avoir consommé des crustacés ou du poisson.
Base
L'extrait de levure, les peptones de viande et la triptein sont la source nutritionnelle de ce milieu. Cependant, la gélose TCBS est un milieu inhospitalier pour la plupart des bactéries.
Sa haute sélectivité est donnée par l'addition de citrate de sodium et de bile de bœuf; tous deux sont des agents inhibiteurs qui fournissent également un pH alcalin au milieu, limitant la croissance de la flore qui l'accompagne et favorisant la croissance de V. cholerae, entre autres espèces. Il est à noter que Vibrio cholerae est très sensible à l'acidité.
De son côté, le chlorure de sodium équilibre osmotiquement le milieu. De plus, sa concentration étant élevée, il agit également comme un agent inhibiteur, favorisant la croissance des bactéries halophiles.
Le saccharose est le sucre fermentescible qui, associé aux indicateurs de pH du bleu de bromothymol et du bleu de thymol, confère au milieu son caractère différentiel. Pour cette raison, avec ce milieu, il est possible de différencier les souches fermentant le saccharose des souches non fermentantes.
Les colonies de souches fermentant le saccharose développent une couleur jaune et font passer le milieu du vert au jaune en raison de la production d'acide. Les non-fermenteurs deviennent translucides et le milieu conserve sa couleur d'origine (vert).
De même, ce milieu contient du thiosulfate de sodium comme source de soufre et du citrate ferrique comme révélateur. Les deux présentent des bactéries capables de produire du sulfure d'hydrogène (gaz incolore). H 2 S est formé à partir de thiosulfate et ensuite, lors de la réaction avec le citrate ferrique, un précipité noir visible se forme.
Enfin, l'agar est ce qui donne la consistance solide au milieu.
préparation
Peser 89 g du milieu déshydraté et dissoudre dans un litre d'eau distillée. Aide à la dissolution en chauffant et en remuant fréquemment. Le mélange peut être bouilli jusqu'à 2 minutes.
Ce milieu n'est pas autoclavé. Après dissolution, il est servi directement sur des assiettes stériles. Lorsqu'elles se solidifient, elles sont disposées de façon inversée sur les plaquettes et conservées au réfrigérateur (2-8 ° C) jusqu'à utilisation.
Le milieu après préparation doit rester à pH 8,6 ± 0,2.
La couleur du support déshydraté est beige clair ou beige verdâtre, et la couleur du support est vert forêt ou vert bleuâtre.
Il est important de laisser les plaques se réchauffer avant de semer les échantillons.
Utilisation
Le spécimen le plus courant pour l'isolement de Vibrios est les selles diarrhéiques.
Les échantillons de selles, s'ils ne peuvent pas être immédiatement ensemencés sur le milieu sélectif, doivent être transportés sur le milieu Cary Blair.
Pour augmenter la sensibilité de la culture, les matières fécales peuvent être passées à travers de l'eau peptonée à pH 8,4 comme milieu d'enrichissement pendant un maximum de 8 heures, à partir de là, elles sont repiquées dans le milieu TCBS.
Il faut également tenir compte du fait que certaines souches de Vibrios peuvent provoquer une septicémie chez les patients immunodéprimés, elles peuvent donc être isolées à partir d'hémocultures. De même, des échantillons d'eau et de nourriture de la mer peuvent être analysés en cas d'épidémie de choléra.
Semé
L'inoculum de l'échantillon d'étude doit être proéminent, le semis est réalisé par la méthode de striation par épuisement. Les plaques sont incubées à 37 ° C pendant 24 heures en aérobiose.
Les colonies présumées de Vibrio cholerae sont de taille moyenne, lisses, opaques, avec des bordures minces et de couleur jaune en raison de la fermentation du saccharose.
Les espèces de V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. Furnissii, V. metschnikovii et certains V. vulnificus poussent de la même manière. D'autres espèces de Vibrios cliniquement importantes telles que V. parahaemolyticus ne fermentent pas le saccharose, se développant sous forme de colonies vert olive.
Plaque de gélose TCBS ensemencée avec Vibrio parahaemolyticus. Source: isis325 Flickr
D'autre part, il faut garder à l'esprit que certaines souches d'Aeromonas et de Plesiomonas qui sont oxydase (+) peuvent se développer dans ce milieu, développant des colonies jaunes qui peuvent dérouter le clinicien. Alors que certaines souches de Pseudomonas également oxydase (+) se développent sous forme de colonies vertes comme V. parahaemolyticus.
Limitation
Le test d'oxydase qui est positif pour le genre Vibrio ne doit jamais être réalisé à partir de colonies obtenues à partir de gélose TCBS, car le résultat obtenu sera un faux négatif. Les composés au milieu interfèrent fortement avec ce test. Par conséquent, il doit être fabriqué à partir de sous-cultures sur gélose au sang.
Contrôle de qualité
Pour prouver que le milieu est en bon état, il est conseillé de semer des souches témoins connues ou certifiées, et d'observer si la croissance répond aux caractéristiques attendues.
Pour cela, vous pouvez utiliser des souches de:
-Vibrio cholerae -– Croissance satisfaisante (colonies jaunes, bordure translucide).
-Vibrio parahaemolyticus --– Croissance satisfaisante (colonie avec centre vert et bordure translucide).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - croissance satisfaisante (colonies jaunes avec des halos de la même couleur autour de la colonie).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - inhibition totale ou partielle (petites colonies jaunes ou translucides).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-– inhibition partielle ou totale (colonies bleues).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Complètement inhibé.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– Inhibition totale ou partielle. (Petites colonies centre vert bordure translucide)
L'incubation du milieu non ensemencé ne doit pas être modifiée.
Références
- Laboratoires Difco Francisco Soria Melguizo. Gélose TCBS. 2009. Disponible sur: f-soria.es
- Laboratoire BD. BD. TCBS Agar 2003. Disponible sur: bd.com
- Laboratoires Britannia. TCBS Medium. 2015. Disponible sur: britanialab.com
- Laboratoires Acumedia. Gélose TCBS. 2016. Disponible sur: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostic microbiologique Bailey & Scott. 12 éd. Éditorial Panamericana SA Argentine.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostic microbiologique. 5e éd. Éditorial Panamericana SA Argentine.