GÉLOSE AU SANG: JUSTIFICATION, UTILISATIONS ET PRÉPARATION - LA BIOLOGIE - 2025

La gélose au sang est un milieu de culture solide enrichi différentiel mais non sélectif. Il est utilisé pour la récupération et la croissance d'une grande variété de micro-organismes à partir d'échantillons cliniques ou pour des repiquages.

La gélose au sang classique doit être incluse pour l'ensemencement de la plupart des échantillons cliniques reçus en laboratoire; sauf pour les échantillons de selles où cela n'est pas utile, à moins d'être préparés avec certaines modifications.

Plaque de gélose au sang

Ce milieu de culture se compose essentiellement d'une gélose de base enrichie et de 5% de sang. La base d'agar peut varier selon les besoins, mais elle sera principalement composée de peptones, d'acides aminés, de vitamines, d'extrait de viande, de chlorure de sodium, d'agar, entre autres.

Quant au sang, il est normalement nécessaire d'être en contact avec un vivarium pour obtenir du sang d'animaux, tels que moutons, lapins ou chevaux. Cependant, ce n'est pas toujours possible et du sang humain est parfois utilisé.

Le milieu de gélose au sang peut être préparé en laboratoire ou peut être acheté prêt à l'emploi auprès d'entreprises dédiées. La préparation de ce milieu est l'une des plus délicates, toute imprudence dans sa préparation se traduira par un lot contaminé.

C'est pourquoi toutes les précautions possibles doivent être prises et à la fin un contrôle qualité doit être effectué en incubant à 37 ° C 1 plaque pour 100 préparées.

Base

Staphylococcus aureus cultivé sur gélose au sang. Nathan Reading sur Flickr Nathan R. sur Twitter, via Wikimedia Commons Il a déjà été mentionné que la gélose au sang a la particularité d'être un milieu enrichi, différentiel et non sélectif. La base de chacune de ces propriétés est expliquée ci-dessous.

La gélose au sang est un milieu enrichi car il contient 5 à 10% de sang sur une base d'agar comme additif principal. Les deux composés contiennent de nombreux nutriments et cette propriété permet à la plupart des bactéries cultivables de s'y développer.

Cette croissance se produit sans restriction; pour cette raison, il est non sélectif. Cependant, si l'on ajoute à ce milieu des composés qui empêchent la croissance de certains microorganismes et favorisent celle d'autres, il devient sélectif. C'est le cas si certains types d'antibiotiques ou d'antifongiques sont ajoutés.

De même, la gélose au sang est un milieu différentiel, car elle permet de distinguer 3 types de bactéries: bêta-hémolytique, alpha-hémolytique et gamma-hémolytique.

Les bêta-hémolytiques sont ceux qui ont la capacité de lyser ou de décomposer complètement les globules rouges, formant un halo clair autour des colonies, ils produisent donc une hémolyse ß ou ß et les micro-organismes sont appelés ß-hémolytiques.

Des exemples de bactéries ß-hémolytiques sont Streptococcus pyogenes et Streptococcus agalactiae.

Les alpha-hémolytiques sont ceux qui effectuent une hémolyse partielle, où l'hémoglobine est oxydée en méthémoglobine, générant une coloration verdâtre autour des colonies. Ce phénomène est connu sous le nom d'hémolyse α ou α et les bactéries sont classées α - hémolytiques.

Des exemples de bactéries α-hémolytiques sont Streptococcus pneumoniae et Streptococcus du groupe viridans.

Enfin, il y a les bactéries dites gamma-hémolytiques ou non hémolytiques. Ceux-ci se développent sur la gélose sans générer de changements sur celle-ci, un effet connu sous le nom d'hémolyse γ, et les microorganismes sont γ-hémolytiques.

Exemple de bactéries γ-hémolytiques: certaines souches de streptocoques du groupe D (Streptococcus bovis et Enterococcus faecalis).

Applications

Le milieu de culture gélose au sang est l'un des plus couramment utilisés dans le laboratoire de microbiologie.

Parmi les microorganismes capables de croître sur le milieu gélose au sang, on trouve: les bactéries strictes aérobies, facultatives, microaérophiles, anaérobies, Gram positives ou Gram négatives, les bactéries à croissance rapide ou à croissance lente.

Certaines bactéries exigeantes ou exigeantes sur le plan nutritionnel se développent également, ainsi que des champignons et des levures. De même, il est utile pour repiquer ou réactiver des souches métaboliquement très faibles.

Cependant, le choix du groupe sanguin et de la gélose de base variera en fonction du microorganisme probable suspecté de se rétablir et de l'usage auquel la plaque sera utilisée (culture ou antibiogramme).

Choix du groupe sanguin

Le sang peut être d'agneau, de lapin, de cheval ou d'humain.

Le plus recommandé est le sang d'agneau, à quelques exceptions près. Par exemple, pour isoler les espèces d'Haemophilus, où le sang recommandé est le sang de cheval ou de lapin, car le sang d'agneau contient des enzymes qui inhibent le facteur V.

Le moins recommandé est l'humain, mais c'est le plus utilisé, peut-être parce que c'est le plus facile à obtenir.

Le sang doit être défibriné, obtenu sans aucun type d'additif et à partir d'animaux sains. Pour l'utilisation du sang humain, plusieurs facteurs doivent être pris en compte:

Si le sang provient d'individus qui ont eu des infections bactériennes, ils auront des anticorps spécifiques. Dans ces conditions, la croissance de certaines bactéries est susceptible d'être inhibée.

S'il est obtenu de la banque de sang, il contient du citrate et certaines bactéries peuvent ne pas se développer en sa présence. En revanche, si le sang provient de patients prenant des antibiotiques, la croissance des bactéries sensibles peut être inhibée.

Et si le sang provient d'une personne diabétique, l'excès de glucose interfère avec le bon développement des profils d'hémolyse.

Choix du type d'agar de base

La gélose de base utilisée pour la préparation de la gélose au sang peut être très large. Parmi eux, on trouve: l'agar nutritif, l'agar d'infusion cerveau-cœur, l'agar trypticase soja, l'agar Müeller Hinton, l'agar Thayer Martin, l'agar Columbia, l'agar Brucella, l'agar Campylobacter, etc.

Utilisations de la gélose au sang selon le milieu de base utilisé pour sa préparation

Gélose nutritive

Cette base est la moins utilisée, car elle permettra principalement de cultiver des bactéries non exigeantes, telles que les bacilles entériques, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, entre autres. Il n'est pas recommandé d'isoler Streptococcus.

Gélose Brain Heart Infusion (BHI)

C'est l'une des bases les plus largement utilisées pour la gélose au sang, car elle contient les nutriments nécessaires à la croissance de la plupart des bactéries, y compris Streptococcus sp et d'autres bactéries exigeantes. Bien qu'il ne soit pas approprié d'observer des modèles d'hémolyse.

Le sang d'agneau est généralement utilisé avec cette base.

Des variantes de gélose au sang peuvent également être préparées, où d'autres composés sont ajoutés pour isoler certains micro-organismes. Par exemple, la gélose Brain Heart Infusion Agar supplémentée avec du sang de lapin, de la cystine et du glucose peut être utilisée pour isoler Francisella tularensis.

Alors que, avec la tellurite de cystine, il est utile pour l'isolement de Corynebacterium diphteriae. Le sang humain ou d'agneau peut être utilisé.

Avec la première bêta-hémolyse sera vue comme un halo étroit, tandis qu'avec la seconde, le halo sera beaucoup plus large.

De même, cette base, associée à la bacitracine, à l'amidon de maïs, au sang de cheval et à d'autres suppléments d'enrichissement (IsoVitaleX), est utilisée pour l'isolement du genre Haemophilus sp à partir d'échantillons respiratoires.

Aussi, si l'association des antibiotiques chloramphénicol - gentamicine ou pénicilline - streptomycine avec du sang de cheval est ajoutée, elle est idéale pour l'isolement de champignons pathogènes exigeants, même avec un rendement plus élevé que la gélose Sabouraud au glucose. Il est particulièrement utile dans l'isolement d'Histoplasma capsulatum.

Gélose trypticase soja

Cette base est la plus recommandée pour une meilleure observation du profil d'hémolyse et pour la réalisation de tests diagnostiques tels que les taxons d'optoquine et la bacitracine. C'est la gélose au sang classique qui est utilisée en routine.

Avec cette base, vous pouvez également préparer la gélose au sang spéciale pour Corynebacterium diphteriae, avec de la tellurite de cystine et du sang d'agneau .

De même, la combinaison de cette gélose avec du sang d'agneau, plus kanamycine-vancomycine est idéale pour la croissance des anaérobies, en particulier Bacteroides sp.

Gélose Müeller Hinton

Cette base complétée de sang est utilisée pour réaliser l'antibiogramme des microorganismes exigeants, tels que Streptococcus sp.

Il est également utile pour l'isolement de bactéries telles que Legionella pneumophila.

Gélose Thayer Martin

Ce milieu est idéal comme base de gélose au sang lorsque le genre Neisseria, en particulier Neisseria meningitidis, est suspecté, car N. gonorrhoeae ne se développe pas sur gélose au sang.

Il est également utilisé pour tester la sensibilité à Neisseria meningitidis.

Gélose Columbia

Cette base est excellente pour l'ensemencement d'échantillons de biopsie gastrique pour Helicobacter pylori.

Le milieu est préparé en ajoutant 7% de sang d'agneau défibriné avec des antibiotiques (vancomycine, triméthoprime, amphotéricine B et céfsulodine) pour limiter la croissance d'autres types de bactéries éventuellement présentes.

Cette même base complétée avec du sang humain ou d'agneau, de l'acide nalidixique et de la colistine est utile pour isoler Gardnerella vaginalis. Il est également idéal pour évaluer la sensibilité aux antimicrobiens aux antibiotiques du même micro-organisme.

De plus, il est utilisé pour la préparation de gélose au sang pour la culture d'anaérobies, en ajoutant des aminosides et de la vancomycine.

Cette base permet une bonne observation des profils d'hémolyse.

Gélose Brucella

Ce milieu utilisé comme base pour la gélose au sang associé à l'ajout de vitamine K est idéal pour la culture de bactéries anaérobies. Dans ce cas, l'utilisation de sang d'agneau est recommandée.

Gélose Campylobacter

La gélose Campylobacter additionnée de 5% de sang de mouton et de 5 antibiotiques (céphalothine, amphotéricine B, triméthoprime, polymyxine B et vancomycine) est le milieu utilisé pour isoler Campylobacter jejuni dans les échantillons de selles.

préparation

Chaque maison commerciale apporte les instructions pour préparer un litre de milieu de culture au dos du récipient. Des calculs correspondants peuvent être effectués pour préparer la quantité souhaitée, en fonction de la gélose de base sélectionnée.

Peser et dissoudre

La gélose de base est déshydratée (poudre), elle doit donc être dissoute dans de l'eau distillée ajustée à pH 7,3.

La quantité indiquée par la gélose de base choisie est pesée et dissoute dans la quantité correspondante d'eau dans un ballon, puis chauffée à chaleur modérée et mélangée avec des mouvements rotatifs jusqu'à ce que toute la poudre soit dissoute.

Stériliser

Une fois dissous, stériliser dans un autoclave à 121 ° C pendant 20 minutes.

Agrégat sanguin

A la sortie de l'autoclave, on laisse refroidir le ballon jusqu'à ce que la température se situe entre 40 et 50 ° C; C'est une température que la peau humaine supporte et en même temps la gélose ne s'est pas encore solidifiée.

Pour ce faire, le flacon est touché avec la main et si la chaleur est tolérable, c'est la température idéale pour ajouter la quantité correspondante de sang défibriné (50 ml pour chaque litre d'agar). Mélangez doucement pour homogénéiser.

Le passage de l'agrégation sanguine est crucial, car s'il est effectué lorsque le milieu est très chaud, les globules rouges se décomposeront et le milieu ne sera pas utilisé pour observer l'hémolyse.

S'il est ajouté trop froid, il s'agglomérera et la surface du support ne sera pas lisse pour permettre une bonne notation.

Verser dans des boîtes de Pétri

Servir dans des boîtes de Pétri stériles immédiatement après l'homogénéisation du sang. Environ 20 ml sont versés dans chaque boîte de Pétri. Cette procédure est effectuée dans une hotte à flux laminaire ou à proximité du brûleur.

Lors du service de la gélose au sang dans les boîtes de Pétri, aucune bulle d'air ne doit rester à la surface de la plaque. Si cela se produit, la flamme du bec Bunsen passe rapidement sur la plaque pour les éliminer.

Les plaques sont laissées à se solidifier et conservées au réfrigérateur (2-8 ° C) à l'envers jusqu'à leur utilisation. Avant d'utiliser les plaques de gélose au sang, elles doivent être trempées (laissées atteindre la température ambiante) pour pouvoir être ensemencées.

Les plaques préparées durent environ 1 semaine.

Références

1. Bayona M. Conditions microbiologiques pour la culture de Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013; 28 (2): 94-99
2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Microbiologie clinique pratique. Université de Cadix, 2e édition. Service des publications de l'UCA.
3. "Gélose au sang." Wikipedia, l'encyclopédie libre. 10 déc.2018, 14:55 UTC. 27 décembre 2018, 01:49 en.wikipedia.org.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostic microbiologique Bailey & Scott. 12 éd. Argentine. Éditorial Panamericana SA
5. Centre de diagnostic vétérinaire du laboratoire CEDIVET. Guatemala. Disponible sur: trensa.com.
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostic microbiologique. (5e éd.). Argentine, Editorial Panamericana SA