ADN RECOMBINANT: TECHNIQUE, APPLICATIONS ET FONDAMENTAUX - LA BIOLOGIE - 2025

L' ADN recombinant (ADNr ou ADNr) est une molécule d'acide nucléique artificielle créée en laboratoire, en intégrant deux segments d'organisations d'intérêt. Il est également connu sous le nom d'ADN chimérique, grâce à sa propriété hybride. Ce type d'ADN ne se trouve pas dans la nature.

La méthodologie de base pour le générer comprend: (a) la sélection d'un ADN cible et son insertion dans un autre fragment d'ADN (généralement un plasmide bactérien); (b) l'introduction de ce plasmide dans une bactérie, (c) la sélection des bactéries au moyen d'antibiotiques et enfin (d) l'expression du gène.

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La technique tire parti d'un ensemble d'enzymes qui permettent de copier et coller des fragments d'ADN spécifiques selon le jugement du chercheur.

Le but de la technologie recombinante est, dans la plupart des cas, l'expression d'une protéine (connue sous le nom de protéine recombinante) souhaitée par le biologiste moléculaire pour des recherches futures ou pour créer une protéine de valeur commerciale et thérapeutique - telle que l'insuline humaine, par exemple.

Bases de la technique de l'ADN recombinant et son utilisation en génie génétique

Le dogme central de la biologie moléculaire

Tous les êtres organiques que nous connaissons partagent plusieurs caractéristiques. L'un d'eux est la nature du matériel génétique et la façon dont les protéines sont fabriquées - un processus connu sous le nom de «dogme» central de la biologie moléculaire.

À l'exception de quelques virus, tous les organismes stockent des informations génétiques dans l'ADN (acide désoxyribonucléique), collectées de manière très compacte et organisée dans le noyau de la cellule.

Pour l'expression génique, la molécule d'ADN est transcrite en ARN messager, et ce dernier est traduit dans le langage des acides aminés, les éléments constitutifs des protéines.

Qu'est-ce qu'un ADN recombinant?

Entre les années 1970 et 1980, les biologistes moléculaires ont commencé à tirer parti des processus qui se produisent naturellement à l'intérieur de la cellule et ont pu les extrapoler au laboratoire.

De cette manière, un gène d'origine animale (un vertébré par exemple) pourrait être inséré dans un segment d'ADN d'une bactérie; ou l'ADN d'une bactérie pourrait être combiné avec un ADN viral. Ainsi, on peut définir un ADN recombinant comme une molécule composée d'ADN de deux organismes différents.

Une fois cette molécule hybride ou recombinante créée, le gène d'intérêt est exprimé. Avec le mot expression, nous voulons faire référence au processus de traduction en protéine.

Enzymes de restriction et ligases: la clé du processus

Un élément clé du développement de la technologie de l'ADN recombinant a été la découverte d'enzymes de restriction.

Ce sont des molécules de protéines qui présentent la capacité de cliver l'ADN (nucléases) en séquences spécifiques, servant de «ciseaux moléculaires». Les fragments générés par ces enzymes sont appelés fragments de restriction.

Ces enzymes peuvent produire des coupes symétriques dans la séquence cible (dans les deux chaînes à la même hauteur) ou des coupes asymétriques. Un aspect clé de l'action des enzymes de restriction est qu'après le clivage des chaînes, un «bord libre» est obtenu, complémentaire de l'autre bord coupé par la même enzyme.

Quelques exemples sont ECOR 1 et Sma 1. Actuellement, plus de 200 types d'enzymes de restriction sont connus et disponibles dans le commerce.

Pour être utile, un ciseau doit être accompagné de la colle. Cette action de scellement de l'ADN (préalablement traité avec des enzymes de restriction) est réalisée par des ligases.

Technique: comment l'ADN d'un organisme est-il modifié artificiellement en laboratoire?

Ci-dessous, nous décrirons les principales étapes requises par la technologie de l'ADN recombinant. Tous sont réalisés par des professionnels dans un laboratoire de biologie moléculaire.

Qu'est-ce qu'un "clone"?

Avant de poursuivre le protocole expérimental, il faut noter qu'en biologie moléculaire et biotechnologie le terme «clone» et le verbe «clone» sont largement utilisés. Cela pourrait prêter à confusion.

Dans ce contexte, on ne parle pas du clonage d'un organisme entier (comme dans le cas du célèbre Dolly le mouton, par exemple), mais du clonage d'un morceau d'ADN, qui peut être un gène. Autrement dit, produire de nombreuses copies - génétiquement identiques - de la séquence.

1. Isolement et obtention d'ADN

La première étape consiste à décider quelle séquence vous souhaitez utiliser. Cela dépend entièrement du chercheur et des objectifs de son travail. Cet ADN doit ensuite être isolé et purifié. Les méthodes et procédures pour y parvenir dépendent à leur tour du corps et des tissus.

Généralement, un morceau de tissu est prélevé et soumis à un traitement dans un tampon de lyse avec de la protéinase K (une enzyme protéolytique) puis l'ADN est extrait. Par la suite, le matériel génétique est fragmenté en petits fragments.

2. Vecteur de clonage

Après les étapes préparatoires, le chercheur cherche à introduire le segment d'ADN d'intérêt dans un vecteur de clonage. Désormais, nous appellerons ce segment d'ADN ADN blanc.

Les plasmides

Un des vecteurs les plus utilisés dans un plasmide d'origine bactérienne. Un plasmide est une molécule d'ADN circulaire à double brin qui se trouve naturellement dans les bactéries. Ils sont étrangers au chromosome bactérien, c'est-à-dire qu'ils sont extrachromosomiques et se trouvent naturellement dans ces procaryotes.

Les éléments de base d'un vecteur sont: (a) une origine de réplication, qui permet la synthèse d'ADN; (b) un agent de sélection, qui permet d'identifier les organismes porteurs du plasmide avec l'ADN cible, comme la résistance à certains antibiotiques; et (c) site de multiclonage, où se trouvent les séquences qui seront reconnues par les enzymes de restriction.

Le premier ADN recombinant réussi en laboratoire a été cloné dans le plasmide pSC101 de la bactérie E. coli. Celui-ci contient un site de restriction pour l'enzyme de restriction EcoRI et un gène de résistance à un antibiotique, en plus de l'origine de réplication.

L'insertion de l'ADN cible dans le plasmide est réalisée à l'aide des outils moléculaires des enzymes de restriction et des ligases décrits dans la section précédente.

Types de vecteurs restants

En plus des plasmides, l'ADN peut être inséré dans d'autres vecteurs, tels que le bactériophage lambda, les cosmides, les YAC (chromosomes artificiels de levure), les BAC (chromosomes artificiels bactériens) et les phagémides.

3. Introduction de l'ADN recombinant

Une fois obtenue la molécule d'ADN recombinant (gène d'intérêt dans le plasmide ou autre vecteur), elle est introduite dans un hôte ou un organisme hôte, qui peut être une bactérie.

Pour introduire de l'ADN étranger dans une bactérie, une technique appelée transformation bactérienne est utilisée, dans laquelle l'organisme est soumis à un traitement avec des cations bivalents qui le rend susceptible d'absorber de l'ADN.

Méthodologiquement, nous ne pouvons garantir que 100% des bactéries de notre culture ont effectivement absorbé notre molécule d'ADN recombinant. C'est là que la partie du plasmide qui contient une résistance aux antibiotiques entre en jeu.

Ainsi, les bactéries qui ont absorbé le plasmide seront résistantes à un certain antibiotique. Pour les sélectionner, il suffira d'appliquer ledit antibiotique et de prendre les survivants.

4. "Récoltez" la protéine

Après avoir sélectionné les bactéries avec notre ADN recombinant, nous procédons à l'utilisation de la machinerie enzymatique de l'hôte pour générer le produit protéique d'intérêt. Au fur et à mesure que les bactéries se reproduisent, le plasmide est transmis à leur progéniture, de sorte qu'il n'est pas perdu pendant la division.

Cette procédure utilise les bactéries comme une sorte d '«usine» de protéines. Nous verrons plus tard qu'il s'agit d'une procédure très pertinente dans le développement de traitements médicaux efficaces.

Une fois que la culture est prête et que les bactéries ont produit de grandes quantités de protéines, la cellule est lysée ou perturbée. Il existe une large gamme de techniques biochimiques permettant la purification des protéines en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques.

Dans un autre contexte expérimental, nous ne sommes peut-être pas intéressés par la génération de la protéine, mais plutôt par l'obtention de la séquence d'ADN en soi. Si tel était le cas, le plasmide serait utilisé pour créer de multiples copies du fragment qui nous intéresse afin d'avoir suffisamment d'ADN cible pour réaliser les expériences pertinentes.

Applications

La technologie de l'ADN recombinant a ouvert un nombre infini de possibilités en biologie moléculaire, biotechnologie, médecine et autres domaines connexes. Ses applications les plus remarquables sont les suivantes.

Analyse génétique

La première application est directement liée aux laboratoires de biologie moléculaire. La technologie de l'ADN recombinant permet aux chercheurs de comprendre la fonction normale des gènes, et les protéines générées peuvent être utilisées dans d'autres recherches.

Industrie pharmaceutique

Les protéines produites en utilisant la procédure de l'ADN recombinant ont des applications en médecine. Deux exemples très pertinents dans le domaine sont l'insuline humaine et l'hormone de croissance, qui sont appliquées aux patients qui n'ont pas cette protéine.

Grâce à l'ADN recombinant, ces protéines peuvent être générées sans qu'il soit nécessaire de les extraire d'un autre être humain, ce qui représente des complications méthodologiques et des risques sanitaires supplémentaires. Cela a contribué à améliorer la qualité de vie d'innombrables patients.

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