AGAR THAYER MARTIN: FOND DE TEINT, PRÉPARATION ET UTILISATIONS - LA BIOLOGIE - 2025

L' agar Thayer Martin c'est un milieu sélectif très nutritif et solide pour l'isolement de Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae; tous deux connus sous le nom de Neisserias pathogènes ou cliniquement importants.

L'une des caractéristiques spéciales les plus importantes de la Thayer Martin Agar est sa teneur élevée en compléments nutritionnels. Cette propriété est essentielle, car les Neisserias sont des microorganismes très exigeants du point de vue nutritionnel et ne poussent donc pas dans les milieux courants.

Thayer Martin / Agar Thayer Martin business medium. Image source 1: prise par l'auteur MSc. Marielsa Gil, image 2. Pixinio.com bactériocolonisé, modifié, Thayer, Martin, gélose.

En revanche, comme ces microorganismes se trouvent normalement dans des zones non stériles, l'ajout d'inhibiteurs est nécessaire pour empêcher la croissance de la flore qui l'accompagne, sans affecter le développement du genre Neisseria.

Cette gélose est composée de gélose à base de GC, d'hémoglobine, de compléments nutritionnels complémentaires et d'un complexe de substances inhibitrices (antibiotiques et antifongiques). Les maisons commerciales vendent chacun des suppléments séparément.

L'échantillon à semer dans ce milieu dépendra du microorganisme recherché. Pour Neisseria gonorrhoeae, les échantillons idéaux sont les sécrétions vaginales et urétrales. Alors que pour Neisseria meningitidis, les échantillons les plus utilisés sont le LCR, les exsudats pharyngés et nasopharyngés.

Base

Les neisserias sont des micro-organismes classés comme gênants et leur isolement est donc difficile. Par conséquent, Thayer Martín est un médium complexe et chacun de ses composants remplit une fonction qui est expliquée ci-dessous:

Gélose de base GC

L'agar GC contient de la protéose peptone, de la fécule de maïs, du chlorure de sodium, du phosphate dipotassique, du phosphate monopotassique et de l'agar-agar. Ses composants fournissent les nutriments de base pour le développement microbien, neutralisent les acides gras toxiques, aident à maintenir l'équilibre osmotique, définissent le pH et donnent une consistance solide au milieu.

Hémoglobine

L'hémoglobine fournit les facteurs V et X (nicotinamide adénine dinucléotide NAD et hémine respectivement). Pour cette raison, les espèces Haemophilus poussent également dans ce milieu. L'hémoglobine peut être obtenue dans le commerce sous une forme déshydratée ou du sang de bovin défibriné frais peut être ajouté au milieu.

Supplément d'enrichissement

D'autre part, un complément d'enrichissement doit également être ajouté au milieu Thayer-Martin, car les nutriments contenus dans la gélose de base ne sont pas suffisants pour les besoins du genre Neisseria.

Le complément d'enrichissement le plus couramment utilisé est appelé isovitalex. Il contient de la glutamine, de l'adénine, du NAD, de la cocarboxylase, de la guanine, du nitrate ferrique, de l'acide p-aminobenzoïque, de la vitamine B12, de la thiamine et du glucose. Tous ces composés sont nécessaires au bon développement des Neisserias pathogènes.

Les inhibiteurs

Comme il s'agit d'un milieu hautement nutritif, il faut utiliser des inhibiteurs qui empêchent la croissance des microorganismes de la flore habituelle de la zone et favorisent ainsi l'isolement du genre Neisseria.

Le complexe inhibiteur est composé de vancomycine, de colistine et de nystatine. La vancomycine inhibe la croissance des bactéries à Gram positif, la colistine empêche la croissance des bactéries à Gram négatif telles que Pseudomonas et certaines Neisserias saprophytes, et la nystatine agit sur les levures telles que Candida albicans.

Cependant, Thayer Martin Agar a été modifié plus tard; les changements consistaient en l'ajout de triméthoprime, l'augmentation de la quantité d'agar et l'ajout de glucose supplémentaire. Ces changements ont considérablement amélioré le rétablissement des espèces de Neisseria gonorrhoeae.

Il convient de noter que le triméthoprime inhibe la croissance du genre Proteus et sa formation d'essaimage qui en résulte. En ce sens, ce sont les antibiotiques qui confèrent le caractère sélectif au milieu Thayer Martin.

préparation

Gélose Thayer Martin originale

-GC agar

Peser 8,2 g de milieu GC déshydraté et mettre en suspension dans 100 ml. Mélangez et faites bouillir pendant 1 minute en remuant fréquemment pour dissoudre complètement. Stérilisez le mélange dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes.

- 2% d'hémoglobine

Suspendre 2 g d'hémoglobine déshydratée dans 2 ou 3 ml d'eau distillée chaude jusqu'à ce qu'un mélange uniforme se forme. Ajoutez petit à petit plus d'eau pour compléter un volume de 100 ml. La suspension doit être homogène avant la stérilisation.

Stériliser en autoclave pendant 15 minutes.

-Complément d'enrichissement

Reconstituer le flacon commercial avec le diluant fourni par la même société commerciale. Bien mélanger. La quantité de diluant à utiliser sera spécifiée dans les instructions du kit.

-Complément d'inhibition du VCN (vancomycine, colistine, nystatine)

Reconstituer le flacon avec le diluant fourni par la société commerciale. Bien mélanger. La quantité de diluant à utiliser sera spécifiée dans les instructions du kit.

-Préparé

Pour 100 ml de gélose GC, procédez comme suit:

Lorsque la gélose GC quitte l'autoclave, laissez-la refroidir à une température d'environ 50 ° C et ajoutez 2 ml de la solution d'hémoglobine préparée, 2 ml du supplément d'enrichissement (isobitalex ou britalex) et 2 ml du supplément d'inhibition. Mélanger et servir dans des boîtes de Pétri stériles.

Laisser solidifier et conserver au réfrigérateur jusqu'à utilisation.

La couleur du milieu préparé est rouge cerise. Le pH final du milieu est de 7,2 ± 0,2

Gélose Thayer Martin modifiée

Peser 8,2 g de milieu GC déshydraté et mettre en suspension dans 100 ml. Ajouter 1 g d'agar-agar et ajouter 0,3 g de glucose. Mélangez et faites bouillir pendant 1 minute en remuant fréquemment pour dissoudre complètement. Stérilisez le mélange dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes.

Préparez l'hémoglobine et le supplément d'enrichissement comme décrit précédemment.

Le supplément de suppression utilisé est le VCNT (vancomycine, colistine, nystatine, triméthoprime).

-Préparé

Procédez comme décrit pour la gélose Thayer Martin d'origine.

Utilisation

Laisser la gélose Thayer Martin se réchauffer avant que les échantillons ne soient striés. Les échantillons couramment utilisés sont les prélèvements pharyngés, les prélèvements nasaux, les écoulements vaginaux, urétraux et / ou rectaux et le LCR.

Utilisez des échantillons frais et faites des inoculums solides sur la gélose. Les échantillons sont ensemencés directement par décharge de matière, puis épuisement striés sur la surface.

Les plaques sont incubées à 35-37 ° C pendant 24 à 48 heures dans un bocal microaérophile (5% CO ₂). À la fin du temps d'incubation, les plaques sont examinées à la recherche de petites colonies grises et parfois d'apparence mucoïde.

Effectuer des tests biochimiques Gram et de confirmation sur les colonies suspectes.

Contrôle de qualité

Les souches microbiennes suivantes peuvent être utilisées pour le contrôle de qualité de la Thayer Martin Agar.

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 et Neisseria meningitidis ATCC 13090; un développement satisfaisant est attendu pour les deux souches.

Les souches suivantes doivent également être incluses: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 et Candida albicans ATCC 10231. Pour toutes, une inhibition totale ou partielle est attendue dans ce milieu.

Limites

-Nous devons garder à l'esprit que les bactéries résistantes aux inhibiteurs utilisés peuvent se développer dans le milieu.

-Il existe des souches de Neisseria gonorrhoeae qui peuvent être sensibles à la concentration de vancomycine utilisée. Pour cette raison, il est recommandé d'utiliser de la gélose au chocolat supplémentée en isovitalex, mais sans inhibiteurs.

-Il existe des souches de levures résistantes à la nystatine qui peuvent se développer dans ce milieu et interférer avec l'isolement des Neisserias pathogènes, notamment les gonocoques.

Références

1. Laboratoires de diagnostic Valtek. Agar Thayer-Martin.2016. Disponible sur: com
2. Laboratoires Britannia. Thayer Martin Medium modifié. 2010. Disponible sur: britanialab.com
3. Contributeurs Wikipedia. Gélose Thayer-Martin. Wikipedia, l'encyclopédie libre. 26 octobre 2017, 16:33 UTC. Disponible sur: wikipedia.org 4. Consulté le 28 février 2019.
4. Laboratoires Britannia. Gélose GC. 2010. Disponible sur: britanialab.com.
5. Laboratoires BBL ™ Enrichissement moyen pour micro-organismes fastidieux. 1999. Disponible sur: bd.com
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostic microbiologique Bailey & Scott. 12 éd. Éditorial Panamericana SA Argentine.