GÉLOSE MÜELLER HINTON: BASE, PRÉPARATION ET UTILISATIONS - LA BIOLOGIE - 2025

La gélose Mueller Hinton n'est pas sélective, le milieu nutritif solide est composé d'infusion de viande, de caséine acide peptonique, d'amidon, d'agar et d'eau distillée. Ce milieu permet une excellente croissance microbienne pour la plupart des bactéries à croissance rapide.

Il a été créé à l'origine par John Howard Müeller et Jane Hinton pour isoler des bactéries exigeantes sur le plan nutritionnel telles que Neisseria gonorrhoeae et Neisseria meningitidis. Cependant, en raison de ses caractéristiques, il s'est avéré idéal pour l'étude de la sensibilité aux antibiotiques, fournissant des résultats fiables et reproductibles.

Antibiogrammes (gélose de Müeller Hinton). Source: Dr Graham Beards sur en.wikipedia

Par conséquent, la gélose Müeller Hinton est le milieu de culture accepté par le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) et le Comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens, pour la réalisation du test de sensibilité aux antimicrobiens par la méthode de diffusion sur disque de Kirby et Bauer.

Base

Étant un milieu nutritif non sélectif, il est excellent pour la croissance de la plupart des bactéries pathogènes.

En revanche, sa composition simple permet une diffusion aisée des substances sur lui, étant une caractéristique essentielle pour le test de sensibilité par la méthode de diffusion sur disque.

Une autre de ses caractéristiques est qu'il contient une faible quantité d'inhibiteurs, ce qui permet d'évaluer efficacement les sulfamides, le triméthoprime et les tétracyclines.

Cependant, il convient de garder à l'esprit que le support doit remplir certaines conditions pour assurer son bon fonctionnement, notamment:

L'ajustement du pH, de la profondeur de la gélose et de la concentration appropriée en thymine, thymidine, Ca ⁺⁺, Mg ⁺⁺ et Zn ⁺⁺.

Vous devez également savoir que la méthodologie est standardisée et que tous les paramètres doivent donc être respectés, tels que:

La concentration de l'inoculum, la concentration et la conservation des disques antibiotiques, le placement du nombre approprié de disques sur la gélose, la distance entre un disque et l'autre, le placement stratégique de certains antibiotiques, l'atmosphère, la température et le temps de incubation.

préparation

Peser 37 g de milieu Müeller Hinton déshydraté et dissoudre dans 1 litre d'eau distillée. Chauffer le milieu tout en remuant pour faciliter la dissolution. Faire bouillir pendant 1 minute.

Autoclave pour stériliser à 121 ° C pendant 15 minutes. Lors du retrait de l'autoclave, le ballon doit être placé dans un bain-marie à 50 ° C pour refroidir. Versez 25 à 30 ml dans des boîtes de Pétri stériles de 10 cm de diamètre.

Les plaques doivent avoir une épaisseur moyenne de 4 mm (idéal), une plage de 3 à 5 mm étant autorisée.

Si vous souhaitez préparer de la gélose au sang en utilisant de la gélose Müeller Hinton comme base, verser 5% de sang d'agneau stérile et défibriné avant de servir sur les plaques.

Le pH final du milieu doit être compris entre 7,2 et 7,4.

Investissez et conservez au réfrigérateur, jusqu'à utilisation. Laisser la plaque revenir à température ambiante avant utilisation.

La couleur du support préparé est beige clair.

Applications

Il est utilisé pour effectuer un antibiogramme ou un test de sensibilité aux antibiotiques pour la plupart des agents pathogènes non exigeants à croissance rapide.

Si la gélose est complétée avec du sang, elle est utilisée pour réaliser l'antibiogramme de microorganismes exigeants tels que: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, entre autres. Il a également été utilisé pour isoler Legionella pneumophila.

Technique d'antibiogramme

Avant d'effectuer l'antibiogramme, une solution bactérienne équivalente à 1,5 x 10 ⁸ cellules doit être préparée.

Pour cela, 3 à 4 colonies de la culture pure sont prélevées et mises en suspension dans un bouillon de trypticase de soja ou dans un bouillon de Müeller Hinton, incubées pendant 2 à 6 heures et la concentration est ajustée avec une solution saline stérile, en la comparant à un standard Mac Farland de 0,5%.

S'il s'agit de microorganismes exigeants, les colonies peuvent être suspendues directement jusqu'à une concentration de 0,5% Mac Farland. Ensuite, la plaque Müeller Hinton est ensemencée avec un tampon imprégné de la solution bactérienne préparée.

Pour ce faire, l'écouvillon est immergé dans la solution puis l'excès de liquide est éliminé en appuyant contre les parois du tube. Immédiatement après, l'écouvillon est passé sur toute la surface, ne laissant aucun endroit intact, puis la plaque est légèrement tournée et elle est à nouveau ensemencée. L'opération est répétée encore 2 fois.

Laisser reposer 10 minutes puis insérer les disques antibiotiques avec une pince stérile, en laissant un espace de 24 mm entre eux. Après avoir placé chaque disque sur la gélose, appuyez légèrement sur chaque disque avec la pince pour s'assurer qu'ils adhèrent bien.

Une fois le processus terminé, la plaque est inversée et incubée à 35-37 ° C en aérobiose pendant 16 à 18 heures. S'il s'agit d'un microorganisme exigeant, il peut mériter une microaérophilie et si l'antibiogramme contient des disques d'oxacilline, il doit être lu après 24 heures.

Une règle est utilisée pour mesurer le diamètre de chaque halo. Les résultats doivent être enregistrés en mm. Par la suite, les valeurs obtenues sont corrélées aux tableaux de points de coupure publiés par le manuel CLSI actuel.

Mesure du halo d'inhibition. Source: USCDCP, Pixnio.com

Déclarer comme sensible (S), intermédiaire (I) ou résistant (R), selon le cas.

Les antibiotiques sont sélectionnés en fonction du microorganisme isolé et du type d'infection qu'il produit.

Parfois, le placement stratégique des antibiotiques doit être gardé à l'esprit pour révéler des schémas phénotypiques de résistance.

Placement stratégique du disque sur la gélose Müeller Hinton

Pour les entérobactéries, le disque d'acide clavulanique doit être placé contre les céphalosporines de 3e et 4e générations. Un élargissement en forme d'œuf indique que la souche est un producteur de bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE). Cela signifie que le patient ne doit pas être traité avec des céphalosporines.

Expression phénotypique de la production de bêta-lactamase à spectre étendu (BLSE) dans une souche d'Escherichia coli. Source: Photo prise par l'auteur MSc. Marielsa gil

Chez Staphylococcus, il est important de placer le disque d'érythromycine ou d'azithromycine devant le disque de clindamycine (test D).

Un halo résistant à l'érythromycine et un aplatissement du halo de clindamycine indiquent que la souche possède une résistance à la clindamycine inductible par la souche (ICR). Cela signifie qu'un traitement à la clindamycine ne sera pas efficace.

Pour rechercher des souches d'AMP C inductibles chez les Enterobacteriaceae et certains bâtonnets Gram négatifs non fermentants, des disques de tazobactan ceftazidime, de céfoxitine ou de pipéracilline sont confrontés à un disque d'imipénème, à une distance de 27 mm.

Un halo aplati dans l'un des disques faisant face à l'imipénème indique la présence d'AMP inductible C.

Pour la recherche de l'AMP C constitutive, un disque de cloxacilline de 500 µg est confronté à la ceftazidime (30 µg) et au céfotaxime (30 µg), à une distance de 25 mm. Un halo élargi dans l'une des céphalosporines indique une positivité.

Le disque de cloxacilline peut également être remplacé par un disque de 9 mm de papier filtre Whatman n ° 6 imprégné d'acide phényl borique (400 ug) à une distance de 18 mm. Il est interprété de la même manière que le précédent.

Enfin, pour étudier la production de métallobétalactamases notamment chez Pseudomonas aeruginosa, on utilise un disque imprégné de 10 µl d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA 750 µg) et d'acide thioglycolique (SMA 300 µg), qui est confronté aux disques d'imipénem et de méropénem, à une distance de 15 mm.

Le test est positif en cas d'élargissement des halos d'imipénème ou de méropénème vers le disque EDTA / SMA. Ce résultat doit être confirmé par le test Hodge modifié.

Cette méthode consiste à inoculer une souche Escherichia coli ATCC 25922 sur la plaque de Müeller Hinton. Un disque d'imipénème est placé au centre de la plaque, puis une strie est faite du disque à la périphérie avec la souche suspectée de P. aeruginosa. Jusqu'à 4 souches peuvent être testées par plaque.

Le test sera positif s'il existe une zone de distorsion du halo d'imipénème autour de la vergeture.

Causes des résultats erronés

- Les disques antibiotiques mal conservés peuvent produire une fausse résistance. Par exemple, le disque d'oxacilline est très vulnérable aux changements de température.

-Un pH du milieu inférieur à celui indiqué (acide) produit des halos plus petits dans les aminosides et macrolides (risque de fausse résistance), et des halos plus gros dans la pénicilline, la tétracycline et la novobiocine (risque de fausse sensibilité).

-Si le pH est supérieur à celui indiqué (alcalin), les effets décrits ci-dessus sont inversés.

-Les milieux à fortes concentrations de thymine et de thymidine ont une influence en réduisant significativement les halos d'inhibition des sulfamides et du triméthoprime.

-Des concentrations élevées de calcium et de magnésium produisent une fausse résistance des aminosides, de la polymyxine B et des tétracyclines contre les souches de Pseudomonas aeruginosa.

- De faibles concentrations de calcium et de magnésium produisent de fausses sensibilités des aminosides, de la polymyxine B et des tétracyclines contre les souches de Pseudomonas aeruginosa.

-La présence de zinc affecte les résultats des disques de carbapénème (imipénème, méropénème et ertapénème).

-L'épaisseur du support inférieure à 3 mm produira de faux résultats de sensibilité, tandis qu'une épaisseur supérieure à 5 produira une fausse résistance.

-La mobilisation des disques dans l'antibiogramme donnera des halos déformés, car la décharge d'antibiotiques est immédiate.

- Des inoculums très faibles affectent les résultats, car il n'y aura pas de croissance uniforme ou confluente dans la gélose, condition nécessaire pour pouvoir mesurer les halos d'inhibition, en plus du fait que les halos peuvent donner plus que la normale.

-Les inoculums surchargés peuvent donner des halos plus petits que la normale.

-Le non-respect de la distance entre les disques provoque le chevauchement d'un halo avec un autre et ils ne peuvent pas être lus correctement.

-Incuber avec du CO ₂ augmente la taille des halos des disques de tétracycline et de méthicilline.

-Incuber à des températures inférieures à 35 ° C produit des halos plus gros.

-L'ajout de sang diminue la taille du halo sulfa.

Limitation

La sensibilité d'un antibiotique démontrée dans l'antibiogramme contre un microorganisme (in vitro) n'est pas une garantie qu'il fonctionnera in vivo.

Contrôle de qualité

Pour savoir si le milieu contient la quantité adéquate de thymine, une souche d'Enterococcus faecalis ATCC 29212 doit être plantée et la sensibilité au triméthoprime sulfaméthoxazole (SXT) doit être testée, elle doit donner un halo égal ou> 20 mm pour être satisfaisante.

Références

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