BILLE D'AGAR STANDARD: JUSTIFICATION, PRÉPARATION ET UTILISATIONS - LA BIOLOGIE - 2025

La gélose de comptage standard est un milieu de culture solide et non sélectif, conçu pour la quantification de la charge microbienne aérobie présente dans des échantillons d'eau potable, d'eaux usées, de boissons laitières, entre autres aliments. Ce milieu est également connu sous le nom d'agar PCA, pour son acronyme en anglais Plate Count Agar. Il a été créé en 1953 par Buchbinder, Baris et Goldstein.

Le milieu gélose de comptage standard est composé d'extrait de levure, de triptein, de glucose, d'agar et d'eau distillée. Cette formulation contient des éléments nutritionnels de base qui permettent le développement de la charge microbienne aérobie actuelle, non exigeante.

Dilutions décimales pour le comptage des CFU dans les comptes de gélose standard. Source: Quentin Geissmann

Comme le milieu ne contient pas d'inhibiteurs, les bactéries peuvent se développer sans aucune restriction, ce qui le rend idéal pour le comptage général des colonies. Cependant, la technique de quantification de plaque ne détectera pas toutes les bactéries présentes, mais seulement celles qui sont capables de croître dans les conditions environnementales auxquelles la gélose de comptage standard ensemencée est soumise.

En ce sens, la technique de quantification sur plaque cherche généralement à déterminer la quantité de bactéries de type aérobie mésophile, c'est-à-dire celles qui se développent à des températures comprises entre 25 et 40 ° C, avec une température de croissance optimale de 37 ° C..

Ce groupe bactérien est très important, car la plupart des bactéries pathogènes de l'homme s'y trouvent.

Il est à noter que parfois il peut être intéressant de quantifier la quantité de bactéries psychrophiles présentes dans les aliments. Ces bactéries sont celles qui se développent à basse température (<20 ° C) et sont responsables de la décomposition plus rapide des aliments, même lorsqu'ils sont réfrigérés.

De même, les bactéries thermophiles, qui se développent dans une plage comprise entre 50 ° C et 80 ° C ou plus, peuvent être importantes dans certains types d'aliments tels que les conserves.

La quantification microbienne est exprimée en unités formant colonie (UFC) par gramme ou millilitre d'échantillon.

Base

Le milieu de comptage standard est conçu pour permettre la croissance réussie de bactéries aérobies non exigeantes car l'extrait de levure, la triptein et le glucose fournissent les nutriments nécessaires à une bonne croissance microbienne.

D'autre part, le milieu a une couleur claire et un aspect transparent, c'est pourquoi il est idéal pour la visualisation des colonies développées par la méthode de l'ensemencement profond (versage dans une plaque).

Le comptage des colonies par la méthode de semis de surface à la spatule Drigalski est également possible.

Lorsque la charge microbienne est élevée, des dilutions décimales de l'échantillon d'étude doivent être effectuées pour pouvoir compter les UFC.

Il est à noter que ce milieu est recommandé par l'American Public Health Association (APHA) pour le dénombrement des mésophiles aérobies.

préparation

Peser 23,5 g de milieu déshydraté et dissoudre dans un litre d'eau distillée. Pour se dissoudre complètement, le mélange doit être chauffé en remuant fréquemment jusqu'à ébullition. Les étapes subséquentes dépendent de la technique d'ensemencement à utiliser.

Pour la technique verseuse

Distribuer en distribuant 12 à 15 ml dans des tubes à essai. Ensuite, stérilisez dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes. Laisser se solidifier verticalement en forme de bloc. Conserver au réfrigérateur jusqu'à utilisation.

Faites fondre la fiche lorsque vous allez l'utiliser. Une fois fondu, gardez-le dans un bain-marie à 44-47 ° C pendant la préparation des échantillons.

Pour semis en surface

Stériliser le milieu dans un autoclave à 121 ° C puis distribuer 20 ml dans des boîtes de Pétri stériles. Laisser solidifier, retourner et conserver au réfrigérateur jusqu'à utilisation.

Tempérer les plaques avant utilisation. Le pH du milieu doit être de 7,0 ± 0,2.

Utilisation

La gélose de dénombrement standard est utilisée dans la technique de comptage aérobie mésophile lors de l'analyse microbiologique de l'eau et des aliments. Le comptage des mésophiles aérobies est nécessaire, car il détermine la qualité sanitaire de l'échantillon étudié.

L'application de cette technique (utilisant ce milieu) permet la visualisation macroscopique des colonies isolées pour leur quantification.

Technique de coulée sur plaque (semis en profondeur)

-Processus

La technique comprend les éléments suivants:

1) Homogénéiser l'échantillon afin de redistribuer les bactéries présentes.

2) Une suspension initiale est réalisée dans un flacon ou une poche stérile, en respectant le rapport de 10 gr ou 10 ml d'échantillon dans 90 ml de diluant (10 ^-1).

3) A partir de la suspension initiale, les dilutions décimales pertinentes sont effectuées en fonction du type d'échantillon. Ex: (10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^-4). Les dilutions sont effectuées avec de l'eau peptonée ou un tampon phosphate.

Pour ce faire, prélevez 1 ml de la suspension initiale et placez-le dans 9 ml de diluant, continuez les dilutions si nécessaire, en prenant maintenant 1 ml de la dilution 10 ^-2 et ainsi de suite.

4) Prélever 1 ml de chaque dilution et placer dans des boîtes de Pétri stériles vides.

5) Ajouter à chaque plaque 12 à 15 ml de gélose standard préalablement fondue et décantée à 44 - 47 ° C.

6) Faites tourner doucement les plaques pour répartir uniformément l'échantillon le long de la gélose et lui permettre de se solidifier.

7) Inverser les plaques et incuber à 37 ° C en aérobiose pendant 24 à 48 heures.

8) A la fin du temps, les plaques sont examinées et les colonies comptées dans la dilution qui le permet. Les plaques qui ont entre 30 et 300 UFC sont choisies pour le comptage.

Le comptage peut être fait manuellement ou vous pouvez utiliser l'équipement de comptage de colonies.

Les valeurs autorisées par ml d'échantillon peuvent varier d'un pays à l'autre en fonction de la réglementation qui les régit.

-Calcul de l'UFC

Le calcul général se fait à l'aide de la formule suivante:

Formule pour le calcul général de la quantification des CFU. Source: Administration nationale des médicaments, des aliments et des technologies médicales (ANMAT). Analyse microbiologique des aliments, méthodologie analytique officielle, microorganismes indicateurs. 2014 Volume 3. Disponible sur: anmat.gov.ar

Exprimez les résultats en 1 ou 2 chiffres, en multipliant par la base 10 appropriée. Exemple: si le résultat est 16 545, il est arrondi en fonction du troisième chiffre à 17 000 et il sera exprimé comme suit: 1,7 x 10 ⁴. Maintenant, si le résultat était de 16 436, arrondissez-le à 16 000 et exprimez 1,6 x 10 ⁴.

Technique d'ensemencement de surface

-Processus

-Inoculaire avec 0,1 ml de l'échantillon direct s'il est liquide, suspension initiale 10 ^-1 ou des dilutions consécutives 10 ^-2, 10 ^-3 etc, au centre d'une plaque de gélose de comptage standard.

-Distribuer l'échantillon uniformément avec une spatule Drigalski ou une tige en verre en L. Laisser reposer 10 minutes.

-Inverser les plaques et incuber en aérobie à 37 ° C pendant 24 à 48 heures.

-Continuer à compter les colonies, choisir les plaques qui sont dans une plage entre 20 et 250 CFU.

-Calcul de l'UFC

Pour le calcul, le facteur de dilution est appliqué, qui est l'inverse. Le nombre est arrondi à 2 chiffres significatifs (arrondi selon le troisième chiffre) et exprimé en puissance de base 10. Par exemple, si 224 CFU sont comptés dans l'échantillon sans dilution (^10-1), 22 x 10 ¹ CFU sont indiqués, mais si le chiffre était de 225, 23 x 10 ¹ CFU sont signalés.

Maintenant, si 199 CFU sont comptés dans la dilution 10 ^-3, 20 x 10 ⁴ CFU seront rapportés, mais si 153 CFU sont comptés dans la même dilution, 15 x 10 ⁴ CFU seront rapportés.

Contrôle de qualité

Le milieu de culture standard peut être évalué à l'aide de souches certifiées connues, telles que: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Si le milieu de culture est dans des conditions optimales, une croissance satisfaisante est attendue dans tous les cas, sauf pour L. fermentum, qui peut avoir un rendement régulier.

Pour évaluer la stérilité du milieu de culture, une ou deux plaques de chaque lot préparé (sans ensemencement) doivent être incubées à 37 ° C en aérobiose pendant 24 heures. Passé ce délai, aucune croissance ou changement de couleur ne doit être observé dans le milieu.

Limites

-Ne faites pas fondre la gélose plus d'une fois.

-Le milieu préparé peut durer jusqu'à 3 mois tant qu'il est conservé au réfrigérateur et à l'abri de la lumière.

-Ce milieu ne convient pas aux micro-organismes exigeants ou anaérobies.

Références

1. Administration nationale des médicaments, des aliments et de la technologie médicale (ANMAT). Analyse microbiologique des aliments, méthodologie analytique officielle, microorganismes indicateurs. 2014 Volume 3. Disponible sur: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Agar de dénombrement sur plaque. 2009. Disponible sur:
3. Laboratoires Conda Pronadisa. Gélose à méthode standard (PCA) selon APHA et ISO 4833. Disponible sur: condalab.com
4. Laboratoires Britannia. Nombre de plaques d'agar. 2015. Disponible sur: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B et Velázquez O. 2009. Techniques d'analyse microbiologique des aliments. 2e éd. Faculté de chimie, UNAM. Mexique. Disponible sur: depa.fquim.unam