COLORATION NÉGATIVE: JUSTIFICATION, TECHNIQUE, AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS - LA BIOLOGIE - 2025

La coloration négative est une méthode de coloration spéciale pour mettre en évidence la présence de la capsule dans certains microorganismes, principalement Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae et Cryptococcus neoformans-, à partir d'échantillons cliniques ou de cultures pures.

L'échantillon direct couramment utilisé pour appliquer une coloration négative est le liquide céphalo-rachidien. Cette technique représente une alternative rapide pour le diagnostic présomptif de la méningite, en particulier de Cryptococcus neoformans.

A. Tartre dentaire taché d'encre de Chine, B. Cryptococcus neoformans var gatti faiblement encapsulé tel qu'il se produit dans la nature, à l'aide de nigrosine. C. Cryptococcus neoformans var gatti avec une capsule épaisse telle que trouvée sous sa forme parasitaire, utilisant la nigrosine. D. Cryptococcus neoformans avec de l'encre de Chine légèrement diluée. Gisell Quinde, de Wikimedia Commons / CDC, via Wikimedia Commons / Crédit photo: Fournisseur (s) de contenu: CDC / Dr. Leanor Haley, via Wikimedia Commons

De même, ce colorant peut être appliqué sur les crachats et les liquides stériles en général, ainsi que sur les souches obtenues à partir de jeunes cultures pures. Cette technique utilise de la nigrosine ou de l'encre de Chine pour son exécution; par conséquent, il s'agit d'une méthodologie très simple et peu coûteuse à appliquer qui fournit des informations d'une grande valeur diagnostique en peu de temps.

En ce sens, tout laboratoire est capable de réaliser cette coloration. Bien entendu, le laboratoire doit disposer d'un personnel compétent, capable de reconnaître les levures Cryptococcus neoformans isolées ou en herbe et de les différencier des leucocytes et des artefacts que l'échantillon peut présenter.

Base

La nigrosine et l'encre de Chine fonctionnent de la même manière; par conséquent, l'une ou l'autre des deux substances peut être utilisée de manière interchangeable.

Cette technique est appelée coloration négative car elle agit de manière contraire au reste des techniques de coloration. En cela, ce qui reste non teint, c'est la structure recherchée ou que l'on souhaite voir; c'est-à-dire des micro-organismes.

Par conséquent, la coloration est basée sur la coloration du bas du frottis d'une couleur sombre. Dans ce scénario, les structures capsulées se démarqueront par une couleur claire ou incolore.

En général, les levures sont réfringentes, entourées d'un halo clair qui correspond à la capsule. Cela se produit parce que l'encre de Chine et la nigrosine sont des substances incapables de pénétrer le polysaccharide qui compose la capsule des micro-organismes vivants.

Il est à noter que d'autres structures qui peuvent être présentes dans l'échantillon direct, comme les leucocytes ou les globules rouges, ne pénètrent pas non plus.

Cependant, si les microorganismes sont morts, le colorant peut pénétrer à l'intérieur d'eux, de sorte que cette coloration est également utile pour évaluer la viabilité des microorganismes.

Technique

matériaux

Nigrosine

La nigrosine doit son nom à sa couleur noire. Il s'agit d'une substance synthétique qui est obtenue en chauffant le mélange de composés organiques -comme la nitrobenzine, l'aniline et le chlorhydrate d'aniline-, à l'aide d'un catalyseur (fer ou cuivre) dans ladite réaction.

Encre Chine

L'encre de Chine est une substance principalement utilisée par les Asiatiques pour l'écriture, la création d'œuvres d'art et la peinture monochromatique. Il est très populaire dans la culture chinoise.

Il est obtenu à partir de l'encre de seiche mélangée à du charbon de bois pulvérisé, le produit de la combustion d'arbres à faible teneur en résine.

Il est également possible de le préparer à partir de la suie issue de l'incinération d'hydrocarbures (huiles végétales), ainsi que d'une gélatine protéique qui lui donne la bonne consistance pour éviter la précipitation de particules de carbone.

Spécifications d'échantillonnage

- Il ne nécessite pas de jeûne.

- L'échantillon de LCR, d'expectoration ou de liquide stérile doit contenir au moins 1 ml de volume et doit être transféré immédiatement au laboratoire à température ambiante.

- Les échantillons de LCR et de liquide stérile doivent être prélevés par un médecin spécialisé.

- Il peut également s'agir d'une pure culture d'une souche suspecte liée aux agents pathogènes précités.

Exécution de la technique avec des échantillons directs

- Les échantillons doivent être centrifugés, puis le surnageant est jeté et le sédiment est prélevé.

- Une goutte de matériel centrifugé (sédiment) et une goutte d'encre de Chine ou de nigrosine sont déposées sur une lame propre.

- Il doit être bien mélangé et recouvert d'une feuille de lamelle, permettant à la goutte de s'étaler sous forme de film mince sans dépasser les bords.

- Ensuite, la préparation est montée sur le microscope.

- Si la préparation est trop foncée, elle peut être diluée avec de l'eau.

Exécution de la technique avec des souches de culture

- Une très petite partie est prélevée sur une jeune culture avec une aiguille de semis et dissoute dans une goutte d'encre de Chine préalablement placée sur une lame propre.

- Une lamelle est placée sur le dessus.

- Il est observé au microscope à 10X puis à 40X.

Vous pouvez également dissoudre une partie de la colonie dans de l'eau distillée, puis en prendre une goutte et la mélanger à l'encre de Chine. De cette manière, la préparation ne sera pas aussi épaisse, ce qui permettra d'observer les structures isolément; s'il y a foule, ce ne sera pas bien observé.

Une autre méthodologie est la suivante:

- Déposer une goutte de la culture en suspension sur une extrémité de la lame.

- Déposer une goutte de nigrosine à la même extrémité et mélanger.

- A l'aide d'une autre lame, étalez l'échantillon comme si vous faisiez un frottis hématologique.

- Laisser sécher et observer au microscope.

Observation au microscope

Vous devez d'abord vous concentrer avec un objectif 10X pour avoir une vue large du champ. Par la suite, il faut chercher s'il y a des espaces libres; s'il y en a, concentrez-vous sur 40X pour voir les détails.

avantage

- C'est facile à exécuter.

- C'est une technique peu coûteuse.

- Cette méthode ne nécessite pas que le frottis soit fixé à la chaleur ou avec des produits chimiques; par conséquent, les micro-organismes sont observés sans distorsions.

- La préparation fraîche n'a pas besoin d'être séchée, elle peut donc être observée immédiatement, générant des résultats rapidement.

Désavantage

Une fois assemblées, les préparations fraîches doivent être observées immédiatement; si on les laisse sécher, il n'est plus possible de les observer et un nouveau doit être installé.

Coloration des tissus à l'encre de Chine

Une autre fonction que peut remplir l'encre de Chine est celle des laboratoires de pathologie. Ceci est appliqué à des échantillons de tissus extraits chirurgicalement afin de marquer les marges de résection de la tumeur.

Le tissu marqué est pulvérisé avec de l'acide acétique. Cela agit comme un mordant et empêche l'encre de fuir lorsque le tissu est soumis à un traitement de routine pour la préparation de biopsie.

La procédure consiste à baigner le tissu dans de l'alcool et du xylène, puis à le tremper dans de la cire de paraffine. Ce marquage guide le pathologiste lors de l'observation du tissu, indiquant où se trouve la marge de résection chirurgicale ou tout autre point d'intérêt.

Références

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