TACHE DE WRIGHT: JUSTIFICATION, MATÉRIAUX, TECHNIQUE ET UTILISATIONS - LA BIOLOGIE - 2025

La coloration de Wright est une technique de coloration créée par le pathologiste américain James Homer Wright en 1902, basée sur la coloration Romanowsky. Le colorant de Romanowsky étant instable, Wright a incorporé du méthanol comme solvant et fixateur.

Cette coloration est polychromatique, ce qui signifie qu'elle génère plusieurs couleurs en fonction de la structure qui absorbe le colorant. Cette technique de coloration a été largement utilisée pour effectuer des numérations différentielles de globules blancs et pour étudier la morphologie des globules rouges, des plaquettes et des leucocytes dans le sang périphérique et la moelle osseuse.

Divers frottis de sang périphérique colorés avec la tache de Wright. A. Leucémie aiguë B. Plasmodium vivax dans l'érythrocyte. C. Plasmodium falciparum, macrogamétocyte. D. Lymphocyte

Son application est très importante, car des anomalies peuvent être observées dans les différentes lignées cellulaires du sang, facilitant le diagnostic de maladies telles que la leucémie ou les infections bactériennes ou parasitaires.

Ce sont peut-être les applications les plus courantes dans lesquelles cette technique est utilisée, mais ce ne sont pas les seules. Il est également utile dans des échantillons autres que le sang et la moelle osseuse, tels que les écoulements nasaux, le mucus fécal, les expectorations, les échantillons de peau, entre autres.

Raison d'être de la tache de Wright

La tache de Wright est née de la tache de Romanowsky, qui consiste en une solution d'alcool méthylique d'un colorant acide (éosine Y) et d'un colorant basique (bleu de méthylène) et de leurs produits d'oxydation.

Le mélange de colorants utilisé dans la coloration de Wright provoque l'effet connu sous le nom de Romanowsky, c'est-à-dire qu'il donne une belle coloration violette aux noyaux des leucocytes et des granules neutrophiles, tandis que les globules rouges se colorent en rose.

Les composants responsables de donner la gamme de couleurs typique de la coloration de Wright sont le bleu B et l'éosine Y. L'effet observé dépendra de la liaison des colorants aux structures chimiques et des interactions du bleu B et de l'éosine Y.

Les structures acides telles que les acides nucléiques, les protéines nucléaires et le cytoplasme immature réactif de certains types de cellules, fixent le bleu B (coloration basique).

Alors que les structures basiques telles que l'hémoglobine, les granules d'éosinophiles segmentés, entre autres structures cellulaires, se lient à l'éosine Y (colorant acide).

Le résultat de la coloration peut être influencé par différents facteurs, tels que le pH du colorant Wright, le tampon et la solution de lavage; ainsi que le temps de coloration et de fixation.

Par conséquent, chaque étape de la préparation des réactifs est cruciale et doit être effectuée avec une attention particulière à chaque détail.

matériaux

La tache de Wright. Pour 100 ml, il faut:

Pesez 0,3 g de colorant de Wright, mesurez 97 ml de méthanol et 3 ml de glycérol.

préparation

Dans un mortier, placer la grande quantité de colorant de Wright et incorporer progressivement le glycérol jusqu'à ce que la poudre soit complètement dissoute.

Ensuite, le méthanol est ajouté, mélangé et versé dans une bouteille ambrée.

Avant utilisation, la solution doit être agitée avec des mouvements doux et filtrée.

Solution tampon tamponnée

Dans un litre d'eau distillée, on ajoute 3,76 g d'hydrophosphate disodique (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) plus 2,1 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH ₂ PO ₄).

Mélangez très bien jusqu'à ce que tous les réactifs incorporés soient dissous. Ajustez le pH à 7,2. Verser dans un bocal en verre et conserver à température ambiante.

Matériel supplémentaire nécessaire pour effectuer la coloration

De plus, d'autres matériaux sont nécessaires pour pouvoir réaliser la technique de coloration, ce sont: des objets glisse ou recouvre des objets, un pont de coloration, des t-shirts avec de l'eau ou un tampon pour le lavage, un chronomètre pour garder les temps de coloration et du matériel de séchage (papier absorbant, gaze ou coton).

Composants de la tache de Wright

Méthanol

L'alcool (méthanol) sert de fixateur du frottis sanguin sur la lame.

Il s'agit essentiellement d'un réactif de réduction, de déshydratation et de fixation de coagulant. Par conséquent, sa fonction est de coaguler les protéines et de les rendre insolubles, mais sans pour autant les dénaturer.

Le méthanol est le réactif de fixation de frottis le plus utilisé dans tous les laboratoires, car il donne de meilleurs résultats que l'éthanol. La concentration idéale est de 99%.

Amortisseur

Le tampon (solution tamponnée) a pour fonction d'ajuster ou de maintenir le pH du colorant, puisqu'un pH ajusté à 7,2 est essentiel pour que les structures cellulaires puissent absorber correctement les colorants.

D'autre part, l'étape de fixation du méthanol déshydrate les cellules et le tampon aide à les réhydrater.

Éosine (Y)

L'éosine a une affinité pour les blocs de construction car il s'agit d'un colorant acide. Deux types d'éosine sont connus très similaires les uns aux autres, à tel point que l'un ou l'autre des deux peut être utilisé, obtenant le même résultat.

L'un est appelé éosine Y, éosine jaune ou tétrabromofluorescéine, et l'autre est appelé éosine B, érythrosine B bleuâtre ou dibromodinitrofluorescéine. Cependant, l'éosine Y est la plus couramment utilisée.

La propriété la plus importante de ce colorant est sa polarité négative, ce qui le rend attiré par les structures cellulaires chargées positivement.

Bleu de méthylène

C'est la coloration de base. Sa propriété principale est la métachromasie, c'est-à-dire que toutes les structures ne seront pas colorées de la même couleur, cela dépend de la composition chimique des structures qui sont colorées.

Certains deviendront bleu clair ou bleu foncé, et certains deviendront violet foncé ou lilas pâle.

Technique

1-Effectuer l'étalement de l'échantillon de manière à ce qu'il reste un film mince, soit sur une lame ou une lamelle.

2-Laissez sécher à l'air pendant environ 2 heures.

3-Placer le frottis sec sur le pont de coloration ou le plateau de coloration avec l'étalement de l'échantillon vers le haut.

4-Couvrir la feuille avec le colorant Wright goutte à goutte jusqu'à ce que toute la surface soit recouverte. Laisser agir 5 à 8 minutes.

5-La tache doit recouvrir complètement la lame, sans déborder sur les bords. Si pendant le temps de coloration il commence à s'évaporer, ajoutez quelques gouttes supplémentaires.

6-Ajoutez ensuite une quantité égale d'amortisseur, soufflez un peu jusqu'à ce que l'éclat métallique caractéristique apparaisse. Durée 10 à 15 minutes.

7-Laver à l'eau du robinet, en plaçant le jet doux jusqu'à ce que la feuille soit rose.

8-Avec une gaze imbibée d'alcool, retirez le colorant collé au dos de la lame.

9-Laisser le frottis très bien sécher avant de placer l'huile d'immersion pour le visualiser au microscope.

Utilitaire

Hématologie

Il est idéal pour la coloration de frottis de sang périphérique, pour l'examen de frottis de sang épais et pour l'étude de cellules d'échantillons de moelle osseuse.

En raison des propriétés chimiques de cette combinaison de colorants, les structures cellulaires peuvent être facilement reconnues et les différents types de cellules présentes peuvent être distingués.

Nez qui coule

Cette technique est très utile pour identifier les cellules de l'écoulement nasal (cellules épithéliales, éosinophiles segmentés, cellules polymorphonucléaires) dans le diagnostic de la rhinite allergique.

parasitologie

En ce sens, il a été utile pour l'étude de Leishmania sp dans les histiocytes du tissu cellulaire sous-cutané dans les ulcères cutanés. De même, il est utilisé pour identifier les leucocytes dans les échantillons de selles (leucogramme fécal).

Dans ce cas, il est intéressant pour le médecin de savoir si la leucocytose présente dans les selles est polymorphonucléaire ou mononucléaire. Cette découverte dans le leucogramme fécal guidera s'il s'agit d'une infection bactérienne ou virale respectivement.

En revanche, les parasites circulant dans le sang peuvent être trouvés dans l'érythrocyte ou libres dans le plasma. Les parasites recherchés sont Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii et filariae, et en médecine vétérinaire, il est utile dans la recherche de Theileria equi et Babesia caballi, agents responsables de la bébésiose, en particulier chez les chevaux.

La coloration de Wright ainsi que la coloration Giemsa permettent de différencier les hémoparasites des composants cellulaires normaux. Deux types de spreads peuvent être utilisés pour cela:

Étalez finement

Le sang est étalé sous forme de film mince sur une lame. Il est coloré avec la coloration de Wright, révélant les caractéristiques du noyau et du cytoplasme.

Goutte épaisse

Cette méthodologie est utilisée pour étudier la présence de parasites dans une plus grande quantité de sang.

Pour ce faire, une grosse goutte de sang est déposée sur une lame. Une fois là, il doit être défibrillé, faisant des cercles de plus en plus grands du centre vers l'extérieur, en utilisant le bord d'une autre diapositive.

Enfin, pour pouvoir observer les parasites dans le frottis épais, les érythrocytes doivent être lysés avec de l'eau.

Infections respiratoires

Au niveau respiratoire, cette technique est également utile, car les cellules présentes dans les prélèvements de crachats, de lavage bronchique ou bronchoalvéolaire, sont importantes pour établir le diagnostic.

De même, les cellules polymorphonucléées et les cellules mononucléées peuvent être distinguées ici.

Bactériologie

L'utilisation de cette technique en bactériologie est limitée, car elle n'est pas bonne pour la coloration des bactéries, c'est pourquoi d'autres techniques de coloration spécialisées sont utilisées pour leur coloration.

Cependant, il a été utilisé pour rechercher des cellules épithéliales avec des corps d'inclusion de Chlamydia trachomatis dans des frottis de muqueuse urétrale ou endocervicale, même s'il faut reconnaître que ce n'est pas la meilleure méthode pour cela.

Il est également possible d'observer des bactéries en forme de spirale telles que Borrelia burgdorferi parmi les globules rouges chez les patients infectés, ainsi que des morulae ou des corps d'inclusion d'Ehrlichia sp dans le cytoplasme des lymphocytes, des monocytes ou des neutrophiles dans un frottis sanguin.

Mycologie

Histoplasma capsulatum est un champignon pathogène fréquemment diagnostiqué par observation microscopique de divers échantillons de tissus, colorés avec le colorant de Wright.

Comment les structures de l'échantillon sanguin sont-elles observées avec la tache de Wright?

Source: Retamales E, Institut de santé publique Mazo V., Gouvernement du Chili. Recommandations pour la coloration des frottis sanguins pour la lecture de l'hémogramme.

Recommandations pour une bonne coloration

Les lames d'échantillons de sang doivent sécher à l'air spontanément. Les frottis doivent être aussi fins que possible pour obtenir une meilleure fixation du colorant et éviter toute coloration excessive.

Pour une coloration de haute qualité, il est conseillé de colorer dans les deux heures suivant la préparation du frottis. En revanche, l'échantillon idéal est le sang capillaire, sans anticoagulant.

Cependant, si du sang veineux est utilisé, il doit être utilisé comme anticoagulant EDTA et non comme héparine, car cette dernière peut déformer les structures cellulaires.

Pour éviter la détérioration du colorant préparé, il doit être conservé dans des endroits secs.

Pendant le processus de lavage, il est recommandé d'utiliser de l'eau ajustée à un pH neutre.

Enfin, il est conseillé de tester de temps à autre les méthodes de coloration utilisées en laboratoire.

Cela se fait en colorant des échantillons ou des motifs étendus, comme un contrôle de qualité. Cette étape est importante, car elle garantit que la coloration est correctement préparée et que les temps de coloration sont bien standardisés.

Si la feuille de patron est mal colorée, il y a des problèmes qui doivent être résolus.

Erreurs courantes dans la coloration de Wright

Taches très pâles

Les frottis très pâles sont généralement dus à un temps de coloration très court ou à un lavage excessif. Il est corrigé en allongeant le temps de contact avec le colorant ou en diminuant le temps de lavage.

Le colorant précipite

La présence de précipités de colorant dans le frottis peut avoir plusieurs causes, cependant, les causes les plus fréquentes sont: utilisation de colorant non filtré, coloration sur des ponts de coloration inégaux, utilisation de feuilles sales de poussière ou de graisse, lavage mal lavé coloration complète.

Frottis extrêmement rouge ou bleu

Le tampon est responsable du pH du colorant. Les colorants dont le pH est inférieur à celui indiqué (acide) entraîneront des frottis très rougeâtres.

Si le pH du colorant est supérieur (alcalin), un frottis extrêmement bleuâtre sera obtenu.

Mode de stockage

Le réactif doit être conservé à température ambiante.

Références

1. Gutiérrez V. Etude comparative entre la méthode de coloration de Wright et le test Elisa pour le diagnostic de l'éhrlichiose canine dans la ville de San Pedro Sula, Honduras. 2008. Thèse de diplôme pour se qualifier pour le diplôme de médecine vétérinaire. Université de San Carlos du Guatemala.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Colorations de base dans le laboratoire de microbiologie. Recherche sur le handicap. 2014; 3 (1): 10-18.
3. «La tache de Wright. Wikipedia, l'encyclopédie libre. 18 mai 2018, 12:05 UTC. 8 déc.2018, 20:37
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