COLORATION AU KINYOUN: JUSTIFICATION ET TECHNIQUES - LA BIOLOGIE - 2025

La coloration Kinyoun est une technique de coloration utilisée pour colorer l'alcool acide résistant aux bactéries et parasites. Il est né de la modification de la coloration Ziehl-Neelsen; Les deux techniques sont interprétées de la même manière mais diffèrent sur deux éléments: dans la préparation du réactif principal et en ce que la technique Kinyoun n'utilise pas de chaleur.

Pour cette raison, il est également connu sous le nom de tache à froid Ziehl-Neelsen ou Kinyoun modifiée à froid. Il est indiqué pour la coloration de Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, mycobactéries atypiques, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris et Cyclosporas cayetanensis.

Cryptosporidium parvum coloré avec un colorant Kinyoun. Punlop Anusonpornperm, de Wikimedia Commons

Il est à noter que Nocardia se colore faiblement avec cette technique car ils sont partiellement résistants à l'acide et à l'alcool, donc pour ce genre, il y a une modification de la méthodologie.

A son tour, la technique du Kinyoun froid a été combinée avec la technique du trichrome modifiée par Didier pour la détection des coccidies (Cryptosporidium parvum et Isospora belli) et des spores de microsporidies (Enterocytozoon bieneusi et Encephalitozoon intestinalis).

Base

Le principal réactif de coloration est la carbolfuchsine ou carbol fuchsine, qui a la propriété de se lier aux acides carboliques de la paroi cellulaire cireuse riche en lipides (acides mycoliques) des mycobactéries et de certains parasites.

Cette liaison n'est pas contrecarrée par l'agent de blanchiment acide; par conséquent, les micro-organismes sont définis comme résistants aux acides.

Contrairement à la technique Ziehl-Neelsen -qui fixe le colorant à la chaleur-, dans la technique Kinyoun cette étape n'est pas nécessaire, car la solution de fuchsine carbolique préparée pour cette technique contient une concentration élevée de phénol.

Le phénol dissout la matière lipidique dans la paroi cellulaire, permettant au colorant carbolfuchsine d'entrer. Une fois le colorant pénétré, il reste fixe malgré le lavage à l'alcool acide.

De cette manière, les microorganismes acido-résistants prennent la couleur rouge caractéristique, tandis que tout ce qui n'est pas acido-résistant se décolore et se colore en bleu.

Technique

matériaux

- Fuchsine carbol modifiée.

- Alcool-acide.

- Bleu de méthylène.

Préparation de Kinyoun carbol fuchsine

- Fuchsine basique: 4 gr.

- Phénol: 8 ml.

- Alcool (95%): 20 ml.

- Eau distillée: 100 ml.

La fuchsine basique doit être dissoute lentement dans l'alcool, en se mélangeant constamment. Ensuite, le phénol cristallisé est fondu dans un bain-marie à 56 ° C. Une fois dissous, 8 ml sont ajoutés à la solution de fuchsine préparée ci-dessus.

Préparation de l'acide-alcool

- Acide chlorhydrique concentré: 3 ml.

- Éthanol (95%): 97 ml.

Il doit être mesuré, joint et mélangé.

Préparation du colorant de contraste bleu de méthylène

- Bleu de méthylène: 0,3 g.

- Eau distillée: 100 ml.

Il est pesé et dissous.

Technique de coloration Kinyoun

1- Préparer un frottis directement à partir de l'échantillon, qui peut être des expectorations, du liquide pulmonaire, des sédiments urinaires, du liquide céphalo-rachidien ou des selles, entre autres; ou à partir d'une suspension de microorganismes obtenue à partir de colonies pures développées dans des milieux de culture primaires.

2- Fixez le frottis à la chaleur.

3- Placer le frottis sur le pont de coloration et couvrir avec le réactif Kinyoun carbol fuchsine préparé. Laissez reposer 3 à 5 minutes.

4- Laver à l'eau distillée.

5- Blanchir avec de l'alcool acide pendant 3 minutes et laver à nouveau avec de l'eau distillée.

6- Bleach à nouveau avec de l'alcool acide pendant 1 ou 2 minutes jusqu'à ce que plus aucun colorant ne soit emporté.

7- Laver à l'eau distillée et laisser égoutter en plaçant la lame en position verticale.

8- Couvrir la préparation de bleu de méthylène et laisser agir 4 minutes.

9- Laver à l'eau distillée et laisser sécher à l'air.

10- Examiner à 40X puis à 100X.

Pour améliorer et accélérer la coloration des microorganismes acido-résistants, ajoutez 1 goutte d'un agent mouillant (tel que Tergitol N ° 7) à 30 à 40 ml de Kinyoun Carbol Fuchsin.

Certains laboratoires changent le colorant de contraste bleu de méthylène en acide vert vif ou picrique; le premier donne une couleur verte à l'arrière-plan et le second génère une couleur jaune.

Technique spéciale kinyoun pour les nocardias

Pour améliorer la coloration des bactéries du genre Nocardia, une modification de la coloration Kinyoun est utilisée. La technique est la suivante:

1- Couvrir le frottis de Kinyoun carbol fuchsine pendant 3 minutes.

2- Laver à l'eau distillée.

3- Décolorer brièvement avec de l'alcool acide préparé à 3% jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de coloration.

4- Laver à nouveau avec de l'eau distillée.

5- Couvrir la préparation de bleu de méthylène et laisser agir 30 secondes.

6- Laver à l'eau distillée et laisser sécher à l'air.

Technique combinée de carbol fuchsine et trichrome modifiée par Didier

Cette technique est recommandée pour l'analyse d'échantillons de selles pour les coccidies et les spores de Microsporidium en même temps. La procédure à suivre est la suivante:

1- Couvrir le frottis avec de la fuchsine Kinyoun carbol pendant 10 minutes.

2- Retirer le colorant et laver à l'eau distillée.

3- Blanchissez pendant 30 secondes avec de l'alcool chlorhydrique.

4- Laver à nouveau avec de l'eau distillée.

5- Couvrir le frottis avec une solution de trichrome pendant 30 minutes à 37 ° C.

6- Laver à l'eau distillée.

7- Blanchir pendant 10 secondes avec de l'alcool acétique.

8- Laver le frottis pendant 30 secondes à l'éthanol à 95%.

Contrôle de qualité

En tant que contrôle positif, des frottis avec des souches de Mycobacterium tuberculosis sont préparés et colorés avec les réactifs préparés pour vérifier que les bactéries prennent la couleur appropriée (rouge-fuchsia).

Des contrôles négatifs peuvent également être utilisés en préparant des frottis avec toute souche autre que l'alcool acide, vérifiant ainsi que l'échantillon entier prend la couleur contrastante.

Technique Kinyoun par rapport à la technique Ziehl-Neelsen

La technique Kinyoun est plus simple puisqu'elle supprime l'étape de chauffage, mais son principal avantage est qu'elle évite l'émission de vapeurs, hautement toxiques et cancérigènes à long terme. Par conséquent, la tache de Kinyoun est plus sûre pour le personnel de coloration.

Il est important de prendre en compte le fait qu'il faut veiller à ce que les réactifs n'entrent pas en contact direct avec la peau, car ils sont corrosifs et l'eau de Javel est inflammable.

Quant aux inconvénients, un frottis négatif n'indique pas nécessairement que l'organisme n'est pas présent. De plus, la présence de débris cellulaires peut conduire à des faux positifs, conduisant à une confusion dans le diagnostic.

Référence

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