COLORATION DE GRAM: JUSTIFICATION, MATÉRIAUX, TECHNIQUE ET UTILISATIONS - LA BIOLOGIE - 2025

La coloration de Gram est la technique de coloration la plus simple et la plus utile en microbiologie diagnostique. Cette technique a été créée par le médecin danois Hans Christian Gram en 1884, qui a réussi à classer les bactéries en Gram positif et Gram négatif, en fonction de la composition de la paroi cellulaire.

La technique a subi certaines modifications par Hucker en 1921 pour stabiliser les réactifs et améliorer la qualité de la coloration, c'est pourquoi la coloration de Gram est également connue sous le nom de Gram-Hucker.

Divers frottis colorés avec une coloration de Gram. A. Cocci à Gram positif. B. Bâtonnets à Gram négatif. C. Bacilles Gram-positifs, polymorphonucléaires et mononucléaires. D. Levures.

Avec cette technique, il est également possible d'observer la forme des micro-organismes, c'est-à-dire s'il s'agit de cocci, bacilles, coccobacilles, pléomorphes, filamenteux, entre autres. Ainsi que sa distribution dans l'espace: en cluster, en chaîne, isolé, par paires, en tétrades, etc.

Lorsqu'une infection bactérienne est suspectée, la plupart des échantillons reçus doivent être étalés sur une lame et colorés au Gram pour un examen microscopique.

Le rapport Gram guidera le médecin sur le type de micro-organisme pouvant être la cause de l'infection, avant d'obtenir le résultat final de la culture.

Dans certains cas, la vie du patient est très compromise, les médecins ont donc un besoin urgent du rapport Gram pour placer un traitement empirique, en attendant l'identification du micro-organisme.

Par exemple, si le Gram révèle qu'il y a des cocci à Gram positif dans le liquide céphalo-rachidien, le médecin guidera le traitement initial avec des antibiotiques qui éliminent ce type de bactéries, selon les protocoles établis à cet effet.

Une fois que le résultat final arrive avec le nom du micro-organisme isolé et son antibiogramme respectif, le médecin évaluera s'il faut ou non changer de traitement. Cette décision sera prise en fonction de l'étude de sensibilité du microorganisme aux antibiotiques qu'il reçoit et de l'évolution du patient.

Base

Il s'agit d'une technique qui comporte 4 étapes fondamentales: coloration, fixation avec le mordant, décoloration et contre-coloration. Par conséquent, en plus de colorer les bactéries, cette technique permet également de les différencier.

Le cristal violet est le premier colorant utilisé. Il a une affinité pour le peptidoglycane et tachera toutes les bactéries présentes en violet, ensuite le lugol est placé, qui agit comme un mordant, c'est-à-dire qu'il induira la formation de complexes cristal violet-iode insolubles - protéines ribonucléaires dans la cellule..

Les bactéries Gram positives, ayant une paroi épaisse de peptidoglycane, forment plus de complexes (cristal violet-iode), donc elles retiennent le colorant.

De plus, cela influence également le fait que la paroi des bactéries Gram positives contient une plus grande quantité d'acides insaturés, qui montrent une grande affinité pour les agents oxydants (Lugol).

Pendant ce temps, les bactéries à Gram négatif ont une fine couche de peptidoglycane, ce qui fait que les bactéries forment moins de complexes que les bactéries à Gram positif.

Vient ensuite l'étape de décoloration, où les bactéries Gram positives et Gram négatives se comportent différemment.

Les bactéries à Gram négatif contiennent une membrane externe riche en lipopolysaccharides qui fait partie de leur paroi cellulaire. Les graisses sont détruites au contact de l'alcool acétonique, de sorte que la membrane externe se déstabilise, libérant le cristal violet.

C'est ainsi qu'il est ensuite contré avec de la safranine ou de la fuchsine basique, devenant rouge.

Dans le cas des bactéries Gram positives, elles résistent à la décoloration car l'eau de Javel agit en fermant les pores, empêchant le complexe cristal violet / iode de s'échapper.

Par conséquent, la coloration au cristal violet reste stable et il n'y a pas de place pour la safranine ou la fuchsine. C'est pourquoi ces bactéries se colorent en bleu foncé ou en violet.

matériaux

L'ensemble de coloration de Gram comprend:

• Verre violet
• Lugol
• Alcool acétonique
• Safranine ou fuchsine basique

Préparation des colorants et des réactifs

Solution de cristal violet

Solution pour:

Cristal violet ------------- 2 gr

Alcool éthylique 95% ----------- 20cc

Solution B:

Oxalate d'ammonium ----------- 0.8 gr

Eau distillée ------------- 80 cc

Pour la préparation finale du cristal violet, la solution A doit être diluée à 1:10 avec de l'eau distillée et mélangée avec 4 parties de solution B. Le mélange est conservé pendant 24 heures avant utilisation. Filtrer dans une bouteille de coloration ambrée en utilisant du papier filtre.

La quantité à utiliser quotidiennement est transférée dans un flacon compte-gouttes orange.

Iodo-Lugol

Pesez et mesurez la quantité indiquée de chaque composé, comme suit:

Cristaux d'iode ------------- 1gr

Iodure de potassium ------------- 2gr

Eau distillée ------------- 300 cc

L'iodure de potassium se dissout petit à petit dans l'eau puis l'iode est ajouté. La solution est rasée dans une bouteille ambrée.

La quantité à utiliser quotidiennement est transférée dans une plus petite bouteille ambrée avec un compte-gouttes.

Blanchiment

95% d'alcool éthylique -----------– 50 ml

Acétone ------------------ 50 ml

Il est préparé à parts égales. Couvrez bien, car il a tendance à s'évaporer.

Placer dans un flacon compte-gouttes.

Cette préparation fournit une décoloration en un temps modéré de 5 à 10 secondes et est la plus recommandée.

Les débutants préfèrent n'utiliser que de l'alcool éthylique à 95%, où la décoloration est plus lente que 10 à 30 secondes.

Alors que les plus expérimentés peuvent utiliser de l'acétone pure, où la décoloration se produit très rapidement de 1 à 5 secondes.

Contraste

Solution mère de Safranin

Safranina -------------– 2,5 gr

Alcool éthylique 95% --------– 100 cc

Après avoir pesé la quantité indiquée de safranine, celle-ci est dissoute dans 100 ml d'alcool éthylique à 95%.

La solution de travail de safranine est préparée à partir de la solution mère.

Pour ce faire, mesurez 10 cc de la solution mère, ajoutez 90 cc d'eau distillée pour faire 100 ml.

Il est recommandé de transférer la quantité à utiliser quotidiennement dans un flacon ambré avec un compte-gouttes.

Les micro-organismes qui se colorent faiblement Gram négatif avec le colorant Gram-Hucker, tels que certains anaérobies, Legionella sp, Campylobacter sp et Brucella sp, peuvent être beaucoup mieux colorés en utilisant la modification de Kopeloff du colorant Gram-Hucker, appelé coloration de Gram-Kopeloff.

Cette technique transforme le colorant safranine en fuchsine basique. Avec cette modification, il est possible de colorer efficacement les micro-organismes mentionnés ci-dessus.

Stockage des réactifs

Les colorants préparés doivent être conservés à température ambiante.

Préparation du frottis de l'échantillon à colorer

Un échantillon doit contenir au moins 10 ⁵ micro-organismes avant que l'observation du micro-organisme dans un frottis soit probable. Les frottis peuvent être réalisés à partir de l'échantillon direct ou à partir de cultures en milieu solide ou liquide.

Les frottis doivent être uniformes, bien répartis et pas trop épais, pour une meilleure visualisation des structures présentes.

-Gramme d'échantillons directs

Gramme d'urine non centrifugée

L'urine est mélangée et 10 µl sont placés sur une lame. L'observation d'au moins une bactérie / champ Dip indique qu'il y a une infection.

Cela signifie que la culture contiendra environ plus de 100 000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) d'urine dans 85% des cas.

Cette méthode n'est pas utile pour les dénombrements de colonies inférieurs à 100 000 UFC.

Gramme de CSF

Le LCR doit être centrifugé, le surnageant retiré et le culot étalé sur une lame. Ce liquide est stérile dans des conditions normales; l'observation des bactéries indique une infection.

Gramme d'échantillons respiratoires

Les crachats, le lavage bronchique ou bronchoalvéolaire de Gram, bien qu'il puisse exister une variété de microorganismes, guideront toujours le diagnostic, en plus d'être utiles au type de cellules observées.

Dans le cas des expectorations, le frottis doit être préparé avec les portions les plus purulentes de l'échantillon.

Gramme de selles

Il n'est pas recommandé d'effectuer un Gram sur ce type d'échantillons, car il n'a aucune valeur diagnostique.

-Gramme de cultures

Ils peuvent être réalisés de deux manières, l'une à partir de cultures liquides et l'autre à partir de cultures solides.

Cultures liquides

À partir de cultures liquides, c'est extrêmement simple; Plusieurs rôtis du bouillon trouble sont pris sous le brûleur et placés sur une lame propre et sèche, en effectuant des mouvements circulaires du centre vers la périphérie, pour répartir uniformément le matériau.

Laissez sécher spontanément à l'air. Une fois sec, le matériau est fixé à la feuille avec de la chaleur. Pour ce faire, à l'aide d'une pince à épiler, la feuille est passée 3 à 4 fois à travers la flamme du bec Bunsen, en prenant soin de ne pas brûler le matériau.

On laisse refroidir la feuille et on la place sur le pont de coloration.

Cultures solides

Pour effectuer un frottis pour la coloration de Gram à partir d'une culture solide, procédez comme suit:

Avant de choisir les colonies à prélever, la lame doit être préparée en plaçant environ deux gouttes de solution saline physiologique stérile.

Si la plaque de culture d'origine contient plusieurs types différents de colonies, une colonie isolée de chacun sera choisie pour effectuer le Gram. Chaque colonie sera prélevée avec la boucle de platine pour se dissoudre dans la solution saline préalablement placée sur la lame.

Des mouvements circulaires sont effectués du centre vers la périphérie, pour répartir de manière homogène la colonie sur la lame.

Laissez sécher spontanément à l'air. Une fois sèche, fixez la plaque à chaud, comme expliqué précédemment (flambage de la lame avec le briquet), en prenant soin de ne pas brûler le matériau.

Cette procédure doit être effectuée avec chaque type de colonie. Sur une feuille de papier, l'ordre de ce qui est observé doit être noté, par exemple:

Colonie 1: colonie jaune bêta-hémolytique: des cocci à Gram positif ont été observés en grappes

Colonie 2: Colonie de couleur crème, sans hémolyse: des coccobacilles à Gram négatif ont été observés.

Chaque diapositive doit être étiquetée pour savoir ce que nous observons.

Technique

La technique de coloration de Gram est extrêmement facile à réaliser et relativement peu coûteuse et ne peut être manquée dans un laboratoire de microbiologie.

Cela se fait comme suit:

1. Fixez le frottis à la chaleur et placez-le sur le pont de coloration.
2. Couvrir complètement la lame de cristal violet pendant 1 minute.
3. Rincer à l'eau Ne pas sécher
4. Couvrir la feuille de solution de lugol, laisser agir 1 minute. Rincer à l'eau Ne séchez pas.
5. Blanchir pendant 5 à 10 secondes en agitant doucement dans de l'acétone alcoolisée. Ou, placez la feuille en position verticale et déposez des gouttes de décolorant sur la surface jusqu'à ce que l'excès de verre violet non retenu soit éliminé. Ne dépasse pas.
6. Rincer à l'eau Ne séchez pas.
7. Remplacer la lame sur le pont de coloration et couvrir pendant 30 secondes avec de la safranine (Gram-Hucker) ou 1 min avec de la fuchsine basique (Gram-Kopeloff).
8. Laver à l'eau
9. Laissez-le sécher à l'air spontanément en position verticale.

Une fois sec, placez 1 goutte d'huile d'immersion pour l'observer sous l'objectif 100X dans le microscope optique.

Utilitaire

Cette technique permet de distinguer les différences morphotintoriales de la plupart des bactéries.

Les levures se distinguent également par cette coloration. Ils prennent le cristal violet, c'est-à-dire qu'ils colorent Gram positif.

D'autre part, on peut distinguer des bacilles Gram-positifs sporulants, dans lesquels un espace clair est observé dans le bacille, où l'endospore s'est formée, bien que les spores ne se colorent pas bien. D'autres techniques telles que Shaeffer-Fulton sont utilisées pour colorer les spores.

Il convient de noter que cette coloration n'est pas utilisée pour colorer tous les types de bactéries, c'est-à-dire qu'il existe des cas dans lesquels la coloration ne fonctionne pas.

Dans ce cas, les bactéries dépourvues de paroi cellulaire peuvent être mentionnées. Par exemple: genre Mycoplasma, sphéroplastes, ureaplasma, formes L et protoplastes.

Il colore également très gravement les bactéries dont les parois sont riches en acides mycoliques, comme les mycobactéries, et les bactéries intracellulaires telles que les chlamydias et les rickettsies.

Il est également inefficace pour colorer la plupart des bactéries spirochètes.

Il existe des bactéries du même genre qui peuvent être observées dans le même échantillon que Gram positif et Gram négatif. Lorsque cela se produit, on parle de coloration de Gram variable, qui peut être due à une modification des nutriments, de la température, du pH ou de la concentration d'électrolytes.

Erreurs fréquentes

Blanchiment exagéré

L'exagération de l'étape de décoloration peut conduire à l'observation de faux micro-organismes Gram négatifs.

Ne pas attendre assez longtemps le temps de séchage pour ajouter l'huile d'immersion

Cela peut provoquer une coloration des bactéries Gram positives à Gram négatif (faux Gram négatif). Cela se produit parce que dans les anciennes cultures, il y a probablement des bactéries mortes ou gâtées et dans ces conditions, les bactéries ne retiennent pas le cristal violet.

Utilisez une très ancienne solution de lugol:

Avec le temps, le lugol perd ses propriétés et sa couleur s'estompe. Si le réactif déjà dégénéré est utilisé, il ne fixera pas bien le cristal violet, il y a donc une possibilité d'obtenir une visualisation de micro-organismes faussement Gram négatifs.

Fond bleu

Un arrière-plan correctement décoloré sera rouge. Un fond bleu indique que la décoloration était insuffisante.

Références

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