COLORATION GIEMSA: JUSTIFICATION, MATÉRIAUX, TECHNIQUE ET UTILISATIONS - LA BIOLOGIE - 2025

Le colorant Giemsa est un type d'échantillons cliniques colorants, basé sur le mélange de colorants acides et basiques. Sa création s'inspire du travail de Romanowsky, où Gustav Giemsa, chimiste et bactériologiste originaire d'Allemagne, l'a perfectionnée en ajoutant du glycérol pour stabiliser les composés.

Les modifications apportées à la technique originale de Romanowsky ont permis d'améliorer considérablement les observations microscopiques, c'est pourquoi la technique a été baptisée du nom de colorant Giemsa.

Divers échantillons colorés avec du colorant Giemsa. A. Trypanosoma evansi dans le sang périphérique. B. Cellules sanguines normales. C. Borrelia theileri dans le sang périphérique. D. Lymphome de Burkitt.

Parce que c'est une technique simple à réaliser, hautement fonctionnelle et économique, elle est actuellement largement utilisée en laboratoire clinique pour les frottis hématologiques, les prélèvements de moelle osseuse et les coupes de tissus.

La technique de coloration au Giemsa est très utile pour les études cytologiques, car elle permet l'observation de structures cellulaires spécifiques. Cette technique colore les cytoplasmes, noyaux, nucléoles, vacuoles et granules de cellules, permettant de distinguer même de fines traces de chromatine.

En outre, des changements significatifs dans la taille, la forme ou la coloration du noyau peuvent être détectés, où il est possible de visualiser la perte de la relation noyau-cytoplasme.

D'autre part, il permet d'identifier les cellules immatures dans la moelle osseuse et le sang périphérique, ce qui est important pour le diagnostic de maladies graves telles que la leucémie. Il est également possible de détecter les hémoparasites, les bactéries extra et intracellulaires, les champignons, entre autres.

En cytogénétique, il est largement utilisé, car il est possible d'étudier la mitose des cellules.

Base de coloration au Giemsa

Les colorants de type Romanowsky sont basés sur l'utilisation d'un contraste entre les colorants acides et basiques, pour obtenir une coloration des structures basiques et acides respectivement. Comme on peut le voir, il existe une affinité des colorants acides pour tacher les structures basiques et vice versa.

Le colorant basique utilisé est le bleu de méthylène et ses dérivés oxydés (Azure A et Azure B), tandis que le colorant acide est l'éosine.

Les structures acides des cellules sont les acides nucléiques, les granules des basophiles segmentés, entre autres, ils seront donc colorés au bleu de méthylène.

Dans ce même sens, les structures de base des cellules sont l'hémoglobine et certains granules tels que ceux contenus dans les éosinophiles segmentés, entre autres; ceux-ci seront colorés avec de l'éosine.

D'autre part, du fait que le bleu de méthylène et l'azur se caractérisent par le fait d'être des colorants métachromatiques, ils peuvent apporter une teinte variable aux différentes structures en fonction de la charge de polyanions qu'ils possèdent.

C'est ainsi que la combinaison stratégique de colorants basiques et acides parvient à développer un large spectre de couleurs, en fonction des caractéristiques biochimiques de chaque structure, marchant à travers les teintes bleu pâle, bleu foncé, lilas et violet dans le cas des structures acides.

Alors que la coloration apportée par l'éosine est plus stable, générant des couleurs entre l'orange rougeâtre et le saumon.

matériaux

Matériel pour préparer la solution mère

La préparation de la solution mère nécessite de peser 600 mg de colorant de Giemsa en poudre, de mesurer 500 cc d'alcool méthylique sans acétone et 50 cc de glycérine neutre.

Comment préparer la solution mère

Placez la poudre lourde de Giemsa dans un mortier. S'il y a des grumeaux, ils doivent être pulvérisés. Ajouter ensuite une quantité appréciable de glycérine mesurée et bien mélanger. Le mélange obtenu est versé dans une bouteille ambrée très propre.

Le reste de la glycérine est placé dans le mortier. Mélangez à nouveau pour nettoyer le reste du colorant collé aux parois du mortier et versez dans le même pot.

La bouteille est bouchée et placée dans un bain-marie à 55 ° C pendant 2 heures. Pendant qu'il est dans un bain-marie, secouez doucement le mélange toutes les demi-heures environ.

Ensuite, on laisse refroidir le mélange pour placer l'alcool. Auparavant, une partie de l'alcool mesuré est placée dans le mortier pour terminer le lavage du colorant restant, puis elle est ajoutée au mélange avec le reste de l'alcool.

Cette préparation doit être laissée mûrir pendant au moins 2 semaines. La portion utilisée de la solution mère doit être filtrée.

Pour éviter la contamination de la préparation, il est recommandé de transférer la portion qui sera constamment utilisée dans une petite bouteille ambrée avec un compte-gouttes. Remplissez à chaque fois que le réactif est épuisé.

Matériel pour préparer la solution tampon

D'autre part, une solution tampon à pH 7,2 est préparée comme suit:

On pèse jusqu'à 1000 cm ₃ 6,77 g de phosphate de sodium (anhydre) (NaHPO ₄), 2,59 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH ₂ PO ₄) et d'eau distillée.

Préparation finale du colorant

Pour la préparation de la solution de coloration finale, 2 ml de la solution mère filtrée sont mesurés et mélangés avec 6 ml de la solution tampon. Remuer le mélange.

Un fait pertinent qui doit être pris en compte est que les techniques de préparation de la coloration peuvent changer en fonction de l'entreprise commerciale.

Matériel supplémentaire nécessaire pour effectuer la coloration

Outre les matériaux décrits, vous devez avoir des ponts de coloration, des t-shirts avec de l'eau ou du tampon pour le lavage, des diapositives ou des couvertures pour objets, un chronomètre pour contrôler les temps de coloration et du papier buvard ou du matériel pouvant être utilisé pour sécher (gaze ou coton).

Technique

Processus de coloration

1) Avant la coloration, le frottis de l'échantillon doit être prêt sur une lame propre.

Les échantillons peuvent être du sang, de la moelle osseuse, des coupes de tissu histologique ou des échantillons cervico-vaginaux. Il est recommandé que les pâtes à tartiner soient fines et aient 1 à 2 heures de séchage avant la coloration.

2) Sur un pont à colorier, placez toutes les feuilles à colorier. Vous travaillez toujours dans le même ordre et chaque feuille est bien identifiée.

3) Déposer quelques gouttes d'alcool méthylique à 100% (méthanol) sur le frottis et laisser agir pendant 3 à 5 minutes, afin de fixer et de déshydrater l'échantillon.

4) Jeter le méthanol présent sur la feuille et laisser sécher à l'air.

5) Une fois sec, placez la solution de coloration finale avec un compte-gouttes jusqu'à ce que la feuille entière soit couverte. Laisser agir 15 minutes. Certains auteurs recommandent jusqu'à 25 min. Cela dépend de l'entreprise.

6) Égoutter le colorant et laver le frottis avec de l'eau distillée ou avec une solution tampon 7.2.

7) Sur un papier buvard, laissez sécher les feuilles à l'air libre, disposées verticalement à l'aide d'un support.

8) Nettoyez l'arrière de la lame avec un tampon imbibé d'alcool ou un coton-tige pour éliminer toute trace de tache.

Utilitaires

La technique de coloration au Giemsa est utilisée dans divers domaines, parmi lesquels: l'hématologie, la mycologie, la bactériologie, la parasitologie, la cytologie et la cytogénétique.

Hématologie

C'est l'utilisation la plus fréquente de cette tache. Grâce à lui, chacune des cellules présentes dans la moelle osseuse ou les échantillons de sang périphérique peut être identifiée. En plus d'estimer le nombre de chaque série, être capable de détecter une leucocytose ou une leucopénie, une thrombocytopénie, etc.

Parce qu'il est sensible à l'identification des cellules immatures, il est pertinent dans le diagnostic des leucémies aiguës ou chroniques. Il est également possible de faire le diagnostic d'anémie, comme la drépanocytose, la drépanocytose, entre autres.

Mycologie

Dans ce domaine, son utilisation est courante pour rechercher Histoplasma capsulatum (champignon dimorphique intracellulaire) dans des échantillons de tissus.

Bactériologie

Dans les frottis hématologiques colorés avec Giemsa, il est possible de détecter Borrelias sp chez les patients qui présentent la maladie appelée fièvre récurrente. Les spirochètes sont abondants parmi les érythrocytes, dans les échantillons prélevés au pic de la fièvre.

Il est également possible de visualiser des bactéries intracellulaires telles que Rickettsia sp et Chlamydia trachomatis dans les cellules infectées.

parasitologie

Dans le domaine de la parasitologie, la coloration au Giemsa a permis de diagnostiquer des maladies parasitaires telles que le paludisme, la maladie de Chagas et la leishmaniose.

Dans les deux premiers, les parasites Plasmodium sp et Trypanosoma cruzi respectivement peuvent être vus dans le sang périphérique des patients infectés, ils peuvent être trouvés à des stades différents selon le stade de la maladie.

Pour améliorer la recherche de parasites dans le sang, il est recommandé d'utiliser le colorant Giemsa mélangé au colorant May-Grünwald.

De même, la leishmaniose cutanée peut être diagnostiquée en évaluant des échantillons de biopsie cutanée colorés au Giemsa là où le parasite est trouvé.

Cytologie

La coloration au Giemsa est également utilisée pour l'étude cytologique d'échantillons endocervicaux, bien que ce ne soit pas la technique la plus fréquemment utilisée à cette fin.

Mais en cas de rareté des ressources, il peut être utilisé, ayant une fonctionnalité similaire à celle offerte par la technique Papanicolaou et à moindre coût. Cependant, cela nécessite une expertise de la part de l'examinateur.

Cytogénétique

Une caractéristique pertinente de la coloration au Giemsa est sa capacité à se lier fortement aux régions d'ADN riches en adénine et en thymine. Cela permet de visualiser l'ADN pendant la mitose cellulaire, dans différents états de condensation.

Ces études sont nécessaires pour détecter les aberrations chromatiques telles que les duplications, les délétions ou les translocations des différentes régions des chromosomes.

Recherche démontrant l'efficacité du colorant Giemsa

Cannova et al (2016), ont comparé 3 techniques de coloration pour le diagnostic de la leishmaniose cutanée.

Pour cela, ils ont utilisé des échantillons obtenus à partir d'un animal expérimental (Mesocrisetus auratus) inoculé expérimentalement avec des Leishmanias.

Les auteurs ont démontré que la coloration au Giemsa était meilleure que la coloration Pap-mart® et Gaffney. Par conséquent, ils ont considéré que la coloration Giemsa était idéale pour diagnostiquer la leishmaniose cutanée.

Les excellents résultats obtenus par les auteurs sont dus au fait que la combinaison de colorants qui composent le mélange de Giemsa présente les conditions nécessaires pour créer un contraste favorable, permettant de distinguer clairement les structures des amastigotes, à la fois intra et extracellulaire.

Les autres techniques (Pap-mart® et Gaffney) l'ont fait aussi, mais de manière plus faible et donc plus difficile à visualiser. C'est pourquoi la coloration Giemsa est recommandée pour le diagnostic parasitologique de la leishmaniose.

De même, une étude de Ramírez et al (1994) a évalué la validité des colorations de Giemsa et Lendrum dans des frottis conjonctivaux pour l'identification de Chlamydia trachomatis.

Les auteurs ont déterminé que les colorants Giemsa et Ledrum ont une spécificité égale, mais Giemsa s'est avéré plus sensible.

Ceci explique pourquoi la coloration de Giemsa est actuellement la plus utilisée pour le diagnostic des infections à chlamydia, surtout si les ressources sont limitées.

Source: PanReac Applichem ITW Reagents. Tache de Giemsa. Version 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Espagne.

Recommandations pour une bonne coloration

Le séchage des feuilles ne doit pas être accéléré. Il faut s'attendre à un laps de temps raisonnable pour le sécher à l'air libre. Environ 2 heures.

Colorez immédiatement après 2 heures pour de meilleurs résultats.

Pour que les frottis se fixent et se colorent mieux, l'échantillon doit être réparti sur la lame de manière à ce qu'il reste une couche mince et uniforme.

L'échantillon sanguin préféré est capillaire, car le frottis est réalisé directement à partir de la goutte de sang et donc l'échantillon ne contient aucun additif, ce qui favorise le maintien des structures cellulaires.

Cependant, si du sang veineux est utilisé, l'EDTA doit être utilisé comme anticoagulant et non comme héparine, car l'héparine déforme généralement les cellules.

Erreurs courantes dans la coloration au Giemsa

Dans la pratique de cette coloration, des erreurs peuvent être commises. Ils sont mis en évidence par des changements soudains dans les tonalités des structures.

Coloration extrêmement bleue

Cela peut être dû à:

• Frottis très épais
• Dépassement du temps de coloration
• Lavez insuffisamment.
• Utilisation de réactifs bien au-dessus du pH neutre (alcalin).

Dans ces conditions, les couleurs des structures suivantes sont déformées, de telle sorte que les érythrocytes au lieu de se colorer en rose saumon apparaissent en vert, les granules des éosinophiles qui doivent être colorés en rouge brique deviendront bleuâtres ou gris et ainsi de suite il y aura écart dans les tons habituels.

Coloration trop rose

Cela peut être dû à:

• Temps de coloration insuffisant.
• Lavage prolongé ou excessif.
• Mauvais séchage.
• Utilisation de réactifs très acides.

Dans ce cas particulier, les structures qui tachent normalement en bleu ne seront pas presque visibles, tandis que les structures qui tachent en rose auront des teintes très exagérées.

Exemple: les globules rouges deviendront rouge vif ou orange vif, la chromatine nucléaire apparaîtra rose pâle et les granules d'éosinophiles se coloreront en rouge vif profond.

Présence de précipités dans le frottis

Les causes peuvent être:

• Utilisez des films sales ou mal lavés.
• Ne laissez pas le frottis bien sécher.
• Laisser la solution de fixation trop longtemps.
• Lavage inadéquat en fin de coloration.
• Filtration inadéquate ou pas de filtration du colorant utilisé.

Présence d'artefacts morphologiques

Des artefacts morphologiques peuvent apparaître dans les frottis, ce qui rend difficile la visualisation et l'interprétation des structures présentes. Ceci est dû à:

• Type d'anticoagulant utilisé, tel que l'héparine.
• Utilisation de films sales, détériorés ou gras.

Mode de stockage

Après préparation, le colorant doit être conservé à température ambiante (15 à 25 ° C), pour éviter que le colorant ne précipite. Il doit être conservé dans un contenant orange hermétiquement fermé.

Références

1. Cannova D, Brito E et Simons M. Évaluation des techniques de coloration pour le diagnostic de la leishmaniose cutanée. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. Réactifs PanReac Applichem ITW. Tache de Giemsa. Version 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Espagne.
3. Clark G. Staining procedures (1981), 4ème édition. Williams et Willkins.
4. Chimie clinique appliquée. Coloration au Giemsa pour le diagnostic in vitro. Distributeur: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F et Grazioso C. Validité des colorants Giemsa et Lendrum dans les frottis conjonctivaux pour l'identification de Chlamydia trachomatis. Bol de Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Mycologie générale. 1994. 2e éd. Université centrale du Venezuela, éditions de la bibliothèque. Venezuela Caracas.
7. «Tache de Giemsa. Wikipedia, l'encyclopédie libre. 1 sept. 2017, 01:02 UTC. 6 décembre 2018, es.wikipedia.org.