SÉQUENÇAGE ADN: MAXAM-GILBERT, MÉTHODE ET EXEMPLES - LA BIOLOGIE - 2025

Le séquençage de l'ADN (acide désoxyribonucléique) est une procédure dans les laboratoires de biologie moléculaire qui permet de connaître l'ordre des nucléotides dans le matériel génétique d'intérêt. En outre, le séquençage de l'ARN (acide ribonucléique) peut également être divulgué.

Cette technique a été indispensable au développement des sciences biologiques. Elle s'applique également à d'autres domaines de connaissances - tels que le diagnostic médical et les enquêtes médico-légales, par exemple.

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Auparavant, le séquençage d'un brin d'ADN était considéré comme une activité lente et coûteuse, ce qui permettait l'identification de seulement quelques paires de bases dans les oligonucléotides.

Aujourd'hui, avec toutes les avancées de la science, le séquençage de l'ADN est une opération de routine dans de nombreux laboratoires du monde entier grâce à l'apport de près de 50 ans de recherche dans ce domaine. En termes de longueur de chaîne, jusqu'à des millions de paires de bases peuvent être séquencées en très peu de temps.

Pour ce faire, il existe des dizaines de techniques développées dont le prix et la précision varient. Dans cet article, nous décrirons les techniques classiques et modernes, chacune avec ses avantages et ses inconvénients.

Jusqu'à présent, les techniques de séquençage permettent d'obtenir la séquence de génomes complets, des petits procaryotes et levures au génome humain.

Structure de l'ADN

Pour comprendre les méthodes et techniques utilisées pour le séquençage de l'ADN, il est nécessaire de connaître certains aspects clés de la structure et de la composition de la molécule.

L'ADN est une biomolécule présente dans tous les êtres vivants, des bactéries aux grands animaux aquatiques. Les organites - comme les mitochondries et les chloroplastes - ont une molécule d'ADN circulaire à l'intérieur. Même dans certains virus, le matériel génétique trouvé est de l'ADN.

Structurellement, l'ADN est une collection de nucléotides. Chacun est composé d'un glucide, d'une base azotée (A, T, C ou G) et d'un groupement phosphate. Le but du séquençage de l'ADN est de révéler l'ordre dans lequel les quatre bases azotées se trouvent dans la séquence.

L'histoire

Au milieu des années 1950, les chercheurs Watson et Crick ont ​​décrit la structure de l'ADN à l'aide de techniques christolographiques. Cependant, aucun de ces chercheurs n'avait été en mesure de trouver un moyen de démêler la séquence.

Bien qu'il y ait eu certains prédécesseurs, l'événement le plus important a été la création de la méthode Sanger, en 1977. Frederick Sanger, le père de la méthode, était un biochimiste britannique, lauréat de deux prix Nobel pour ses énormes contributions aux sciences biologiques.

Cette technique est également connue dans la littérature sous le nom de "terminaison de chaîne" ou didésoxynucléotides. Les principes de cette technique et ceux qui ont été développés en fonction de son amélioration et de son innovation seront décrits ci-dessous.

Méthode Sanger

Le développement de la méthode Sanger a représenté un événement crucial en biologie moléculaire. Il implique les composants de base du processus de réplication de l'ADN qui se produit normalement dans la cellule, mais en ajoutant un composant spécial: les didésoxynucléotides.

Principaux composants de la réaction

- ADN polymérase: l'enzyme ADN polymérase est un élément crucial du processus. Cette molécule participe à la réplication du brin d'ADN et son rôle est la synthèse du nouveau brin, appariant les désoxyribonucléotides triphosphates avec les complémentaires.

Rappelons que dans l'ADN, les thymines (T) s'apparient avec les adénines (A) via deux liaisons hydrogène, tandis que la cytosine (C) le fait avec la guanine (G) via trois liaisons.

- Nucléotides: le séquençage de Sanger implique deux types de nucléotides, les quatre 2'-désoxynucléotides (abrégés en dATP, dGTP, dCTP et dTTP) et les quatre didésoxynucléotides (ddATP, ddGTP, ddCTP et ddTTP).

Bien que les didésoxynucléotides soient similaires aux monomères qui sont normalement incorporés dans l'ADN, ils n'ont pas de groupe -OH dans leur structure. Cela rend impossible l'ajout d'un nouveau nucléotide à la chaîne.

Par conséquent, lorsqu'un nucléotide spécial est ajouté - de manière totalement aléatoire - à la chaîne en formation, la synthèse est paralysée. Ainsi, à la fin de la réaction, il existe des chaînes de tailles différentes, chacune où la réaction a été arrêtée à un point différent.

Expérimentalement, quatre tests sont préparés. Chacun contient l'ADN extrait de l'échantillon biologique d'intérêt, les nucléotides normaux et l'un des quatre types de nucléotides spéciaux. Soit les nucléotides spéciaux sont marqués avec un certain type de marqueur fluorescent (voir séquençage automatisé ci-dessous).

Lire les résultats

La première étape consiste à séparer chacune des chaînes synthétisées en fonction de leur taille. Certains seront plus longs que d'autres, selon l'endroit où les bases spéciales ont été incorporées.

Il existe différentes techniques biochimiques qui permettent la séparation des composants d'un mélange en utilisant la taille comme propriété discriminatoire. Dans la méthode de Sanger, les différentes chaînes sont séparées par électrophorèse. Dans les variantes les plus sophistiquées de la technique, l'électrophorèse capillaire est utilisée.

Ainsi, les brins plus longs se déplacent moins que les variantes plus courtes. Ce système passe ensuite par un lecteur qui reconnaît le marqueur inclus dans chaque didésoxynucléotide. De cette manière, l'ordre de la séquence peut être connu.

Cette technique de "première génération" est capable de lire des fragments d'ADN ne dépassant pas 1 kilobase. Actuellement, la méthode Sanger est utilisée dans divers laboratoires, généralement dans ses variantes modernes. De plus, il sert à corroborer les résultats obtenus avec les techniques les plus complexes - mais moins précises.

Séquençage automatique

Lorsque le séquençage est nécessaire à grande échelle, le processus est accéléré grâce à l'automatisation. Il s'agit d'une variante de la méthode de terminaison de chaîne de Sanger, où les amorces sont marquées avec des produits fluorescents afin de les distinguer.

Ensuite, le produit de la réaction est soumis à une électrophorèse - le tout sur une seule voie. Lorsque chaque fragment sort de la partie finale du gel, il est rapidement identifié par son marquage fluorescent, avec une erreur d'environ 1%.

Les systèmes les plus sophistiqués disposent d'un système de jusqu'à 96 tubes capillaires gérés par un ordinateur couplé à un robot. Autrement dit, 96 échantillons d'ADN peuvent être testés simultanément. Ainsi, le processus d'électrophorèse et d'analyse des résultats est entièrement automatisé.

En une journée, ces systèmes peuvent séquencer jusqu'à 550 000 bases. Pendant le processus, le travail humain n'est pas nécessaire, cela ne prend que 15 minutes environ pour démarrer la méthode.

Séquençage Maxam-Gilbert

En même temps que Sanger a publié ses travaux, deux chercheurs nommés Allan Maxan et Walter Gilbert ont réussi à développer une autre méthode pour obtenir la séquence d'ADN. La méthode a gagné en popularité à l'époque, mais a ensuite été déplacée par l'amélioration de la méthode de Sanger.

Contrairement à la méthode de Sanger, le séquençage de Maxan et Gilbert (ou séquençage chimique, comme on l'appelle également) n'implique pas de réactions d'hybridation. La méthodologie consiste en un marquage avec des agents réactifs à une extrémité, suivi d'un processus de purification.

L'un des aspects négatifs de cette technique réside dans son énorme complexité et dans l'utilisation de produits chimiques dangereux pour l'utilisateur. Les ruptures chimiques sont induites par l'application de DMS, d'acide formique, d'hydrazine et d'hydrazine avec des sels.

Processus

Le protocole commence par le marquage à l'extrémité 5 'du brin avec le marqueur phosphore 32, puis une modification chimique de la base azotée se produit et celle-ci est séparée. Enfin, le clivage de la région abasique se produit.

Commencez par raccourcir la chaîne que vous souhaitez séquencer en segments plus petits. Cette étape est réalisée avec des enzymes de restriction, qui se traduisent par des extrémités saillantes.

Ensuite, la réaction est effectuée avec une phosphatase alcaline dont le but est d'éliminer le groupe phosphate. Ainsi, une polynucléotide kinase peut être utilisée pour effectuer le marquage.

La chaîne est dénaturée (les deux brins s'ouvrent). Ensuite, les produits chimiques sont appliqués. Ces réactions de clivage sont effectuées de manière contrôlée et on sait quels types de liaisons chaque produit chimique appliqué se rompt.

Lire les résultats

Comme dans la méthode Sanger, la lecture des résultats implique la séparation par taille des chaînes obtenues dans un système d'électrophorèse. Les systèmes composés de polyacrylamide permettent d'obtenir une résolution très adéquate pour la lecture du gel.

Séquençage de masse

Le séquençage massif englobe une série de méthodes nouvelles, abrégées en NGS, de l'anglais «Next Generation Sequencing».

Les méthodes classées NGS nécessitent une étape préalable d'amplification de l'ADN (elles ne fonctionnent pas avec une seule molécule). De plus, les plates-formes utilisées varient considérablement. Les principes des méthodes les plus populaires seront décrits ci-dessous:

Pyroséquençage

Il s'agit de surveiller la libération d'un pyrophosphate, qui se produit chaque fois qu'un nouveau nucléotide est ajouté au brin d'ADN. Un système d'enzymes est couplé, de sorte que l'émission de lumière (qui est détectable par une caméra) se produit chaque fois qu'un nouveau nucléotide est incorporé.

Le processus commence par l'incubation séparée de chaque base azotée pour vérifier s'il y a ou non émission de lumière. Le pyroséquençage peut lire de longs brins, mais le taux d'erreur trouvé est élevé.

Séquençage de synthèse

Cela implique l'incorporation de nucléotides marqués. Ces composants fluorescents sont ajoutés, lavés et le nucléotide incorporé est noté. Ensuite, le marqueur nucléotidique est retiré et la synthèse du brin peut se poursuivre. Dans l'étape suivante, un nucléotide marqué sera également incorporé et les étapes susmentionnées seront répétées.

Un inconvénient de cette technique se produit lorsque les marqueurs fluorescents ne sont pas complètement éliminés. Ces émissions créent des erreurs de fond, entraînant des erreurs importantes.

Séquençage de ligature

Cette technique diffère des autres, car elle n'utilise pas d'ADN polymérase. Au lieu de cela, l'enzyme clé pour cette méthodologie est la ligase. Ici, des fragments d'ADN marqués par fluorescence sont utilisés, il est lié par l'enzyme et il est détecté.

Le plus gros problème avec cette technique est la courte longueur de fragment qu'elle est capable de traiter.

Séquençage Ion Torrent

Cette technique est basée sur la mesure de l'ion H ⁺ qui est libéré à chaque fois qu'un nouveau nucléotide est incorporé. Le principe est assez similaire au pyroséquençage, mais beaucoup moins cher.

Exemples

Le séquençage du génome humain

Le séquençage du génome humain a été l'un des défis les plus prometteurs de la biologie, ainsi que l'une des rivalités les plus acclamées de l'histoire de la science. En fait, pour les scientifiques impliqués dans le projet, le séquençage du génome est devenu un concours.

En 1990, il a lancé ce qu'on a appelé le «projet du génome humain», dirigé par le célèbre scientifique, lauréat du prix Nobel, James Watson. Après un an, en 1991, Venter relève le défi de «battre» Watson et de séquencer le génome avant lui. Cependant, en 1992, Watson a pris sa retraite et le commandement a été pris par un autre chercheur.

En 1995, Venter a annoncé son succès dans le séquençage complet d'un génome bactérien par la méthode de séquençage aléatoire. De même, l'équipe adverse a annoncé un an plus tard le séquençage du génome de la levure.

En 2000, le diplôme a pris fin. Les deux sociétés ont publié leurs résultats préliminaires sur le génome entier dans deux des revues scientifiques les plus prestigieuses: Nature et Science.

Cependant, les scientifiques ont continué à travailler sur l'amélioration des propositions et, en 2006, les séquences de certains chromosomes humains ont été achevées.

Importance et applications

Connaître l'ordre des nucléotides d'une molécule aussi importante que l'ADN est précieux pour les biologistes et les professionnels apparentés. Cette chaîne de polynucléotides contient toutes les informations nécessaires au développement et au maintien de toutes les formes de vie.

Pour ces raisons, la connaissance de cette séquence est essentielle pour la recherche biologique. Fondamentalement, le séquençage permet de mesurer l'une des propriétés les plus importantes des systèmes biologiques et d'établir des différences entre eux.

Le séquençage est largement utilisé par les taxonomistes et les systématistes, car certaines séquences d'ADN permettent d'établir des critères pour conclure si deux organismes appartiennent ou non à la même espèce, en plus de pouvoir proposer des hypothèses sur les relations phylogénétiques entre eux.

De plus, le séquençage de l'ADN a des applications en médecine et en diagnostic. Par exemple, il existe des systèmes peu coûteux et accessibles qui, par séquençage, permettent d'évaluer la tendance à développer certaines maladies (comme le cancer) à l'aide de polymorphismes dits mononucléotidiques (SNP).

Les enquêtes de type criminel et médico-légal ont également été enrichies de techniques de séquençage, qui peuvent être utilisées comme preuve fiable de la participation d'un certain individu à un crime.

Références

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