TEST D'OXYDASE: JUSTIFICATION, PROCÉDURE ET UTILISATIONS - LA BIOLOGIE - 2025

Le test oxydase est une méthode de diagnostic qui montre la présence du complexe enzymatique appelé cytochrome oxydase c. Ce système induit la transformation du cytochrome réduit en oxydé, car il capte l'oxygène et agit à son tour comme le dernier accepteur d'électrons (H ⁺) dans la chaîne respiratoire.

Le terme oxydase est une manière abrégée de désigner l'enzyme cytochrome oxydase, également connue sous le nom d'indophénol oxydase. Dans les temps anciens, on croyait que les enzymes cytochrome oxydase et indophénol oxydase étaient deux enzymes différentes, mais aujourd'hui, on sait qu'elles sont les mêmes.

Test d'oxydase positif et négatif. Source: Aucun auteur lisible par machine fourni. Alpha.prim ~ commonswiki supposé (basé sur les droits d'auteur).

De leur côté, les cytochromes sont des hémoprotéines qui contiennent du fer et complètent le système cytochrome oxydase. Les cytochromes peuvent varier d'une espèce à l'autre.

Il existe différentes variétés de cytochromes (cytochromes a1, a2, a3 et 0). Certaines bactéries ne peuvent en produire qu'une, mais d'autres jusqu'à deux ou trois à la fois. En ce sens, la présence de cytochrome a et a3 est connue sous le nom de cytochrome oxydase c. C'est le type de cytochrome détecté par le test de l'oxydase.

Les genres Neisseria et Pseudomonas contiennent de la cytochrome oxydase c. Ces genres donnent un test d'oxydase positif, aidant à les différencier respectivement des genres Acinetobacter et Stenotrophomonas.

Il existe également d'autres genres positifs à l'oxydase.

Base

Caractéristiques du système cytochrome oxydase c

Le système de cytochrome oxydase c fonctionne de la manière suivante: les micro-organismes oxydase positifs utilisent l'oxygène pour générer de l'énergie par respiration aérobie. Ce système fonctionne grâce au transport d'électrons des substances donneuses telles que le NADH ⁺ vers des substances réceptrices, en l'occurrence l'oxygène.

Cela se traduit par la production d'énergie (ATP) et d'eau ou de peroxyde d'hydrogène, selon le système de cytochrome oxydase que possède le microorganisme.

C'est pourquoi la plupart des bactéries oxydase positives sont également catalase positives, condition nécessaire pour éliminer le peroxyde d'hydrogène produit, car cette substance est toxique pour les bactéries.

Le système cytochrome oxydase c est présent dans certaines bactéries aérobies, certains anaérobies facultatifs, quelques microaérophiles et aucun anaérobie strict. Ce dernier est compréhensible, car les anaérobies stricts ne peuvent pas vivre en présence d'oxygène, ils ne disposent donc pas du système de cytochrome oxydase.

Principe du test

Dans ce test, il utilise des substances qui agissent comme des accepteurs artificiels d'électrons, en remplaçant les substances naturelles dans la chaîne de transport d'électrons.

On utilise principalement des colorants tels que la paraphénylènediamine et l'indophénol, qui agissent comme des substrats récepteurs et des donneurs d'électrons artificiels.

La paraphénylènediamine est oxydée par le système de la cytochrome oxydase c. Le colorant sous sa forme réduite est incolore, mais sous sa forme oxydée, il est coloré.

C'est ainsi que la présence du système cytochrome oxydase c est mise en évidence; car une réaction positive générera une couleur lavande ou bleu-violet selon le réactif utilisé.

En revanche, si la dernière substance acceptant l'électron de la chaîne respiratoire est différente de l'oxygène, le test d'oxydase sera négatif (il n'y a pas de production de couleur); c'est le cas des microorganismes anaérobies.

De même, si le cytochrome utilisé par le microorganisme est différent de la cytochrome oxydase c, il donnera également le test négatif.

Processus

Il existe différents réactifs et protocoles pour le test de l'oxydase, tous dans le même but.

Réactifs

Réactif Kovacs, réactif Gordon et McLeod, réactif Nadi, réactif Carpenter, Suhrland et Morrison, et utilisation de disques oxydase.

-Réactif Kovacs oxydase

Il est composé de 1% de dichlorhydrate de tétraméthyl-p-phénylènediamine.

Le réactif de Kovacs est préparé en dissolvant 1 g de la substance susmentionnée dans 50 ml d'eau distillée. Il est chauffé subtilement jusqu'à dissolution complète. Transférer dans une bouteille ambre de capacité suffisante et compléter le volume à 100 ml avec de l'eau distillée. Attendez au moins 15 minutes avant de l'utiliser. Conserver au réfrigérateur à l'abri de la lumière.

Il est étiqueté réactif Kovacs oxydase, pour le différencier du réactif Kovacs utilisé pour révéler le test indole. Ce réactif est le plus sensible, le moins toxique mais le plus cher que le reste des réactifs.

Une réaction positive sera mise en évidence avec ce réactif avec le changement de couleur de la colonie en lavande, qui vire rapidement au violet presque noir. Une réaction négative est évidente car il n'y a pas de changement de couleur dans la colonie ou elle prend une légère couleur rosâtre. Le milieu peut également s'assombrir, mais cela ne signifie pas une réaction positive.

Avec ce réactif, le temps de réaction est crucial, un changement de couleur qui se produit entre 5 et 15 secondes est considéré comme une réaction positive.

-Réactif Gordon et McLeod

Il est composé de dichlorhydrate de diméthyl-p-phénylènediamine, également connu sous le nom de monochlorhydrate de N-diméthyl-p-phénylènediamine ou de p-aminodiméthylaniline. Il est préparé comme décrit pour le réactif Kovacs oxydase, en remplacement de la substance impliquée.

Ce réactif est légèrement plus stable que le réactif Kovacs oxydase, bien que tous les réactifs contenant de la p-phénylènediamine soient instables.

Cette réaction est plus tardive, elle est interprétée comme positive avec l'apparition d'une couleur bleu-violet en 10 à 30 minutes.

-Réactif Nadi

Il est composé de 1% d'α-naphtol dans l'alcool éthylique (95% d'éthanol) et de 1% d'aminodiméthylaniline. Le mélange est préparé à parts égales et en utilisant de l'alcool éthylique absolu comme diluant, jusqu'à compléter une quantité suffisante pour 100 ml.

-Réactif de charpentier, Suhrland et Morrison

Il est composé d'oxalate de p-aminodiméthylalanine à 1%. Préparer de la même manière que celle décrite pour le réactif Kovacs oxydase, en changeant pour la substance correspondante.

La solution étant prête, les bandelettes de test sont préparées comme suit: Des bandelettes de papier filtre Whatman N ° 1 de 6 à 8 cm sont imprégnées avec 1% de réactif oxalate de diméthyl-p-phénylènediamine.

Ils sont autorisés à sécher sans contact avec le métal, à conserver dans des bocaux à bouchon à vis avec un dessicant et à conserver au réfrigérateur. Ces bandelettes sont stables jusqu'à 6 mois.

C'est le réactif le plus stable de tous ceux mentionnés et peut durer jusqu'à 6 mois en solution. Un autre avantage est qu'il ne colore pas le milieu autour de la colonie, s'il est utilisé directement sur l'assiette.

L'apparition d'une couleur rouge est interprétée comme un test positif.

-Disques Oxidase

Ce sont des disques commerciaux qui sont imprégnés de réactif pour le test de l'oxydase. Il existe plusieurs marques commerciales sur le marché.

Son utilisation est assez pratique, car il n'est pas nécessaire de préparer des réactifs frais, ce qui facilite le travail. Les résultats obtenus sont fiables tant que les disques sont correctement conservés.

Protocoles

Méthode par plaque directe, méthode indirecte sur papier et utilisation de disques imprégnés de réactifs oxydase.

-Méthode de carte directe

2 ou 3 gouttes de l'un quelconque des réactifs précités sont ajoutées à cet effet directement sur la ou les colonies contenues dans une plaque de milieu de culture ne contenant pas de glucose.

Le changement ou non de couleur des colonies est interprété, non du milieu. Le temps de réaction valide dépend du réactif utilisé.

-Méthode indirecte sur papier

Découpez un morceau de papier filtre (Whatman n ° 1) de 6 cm ² et placez-le dans une boîte de Pétri vide.

Ajouter 2 ou 3 gouttes de réactif Kovacs oxydase sur le papier, faire partie de la colonie à étudier avec un manche en platine ou un cure-dent en bois et l'étaler en ligne droite sur le papier imprégné de réactif. Interprétez en 5 à 10 secondes.

Avec les bandelettes préparées avec les réactifs Carpenter, Suhrland et Morrison, une colonie est étalée sur la bandelette sèche. Une seule bandelette est utilisée pour tester plusieurs souches. Interpréter en 10 sec.

-Disques (m

Humidifiez subtilement les disques commerciaux avec de l'eau distillée stérile et superposez-les sur la colonie à étudier. Il est recommandé d'utiliser les plaques à 35 ° C, si des plaques à température ambiante ou des plaques réfrigérées sont utilisées, la réaction est un peu plus lente. Interprétez le changement de couleur entre 10 et 20 secondes.

Les colonies contenues sur de la gélose au sang ou au chocolat peuvent être utilisées.

-Disques (méthode indirecte)

Humidifiez le disque comme décrit précédemment. Placez-le dans une boîte de Pétri vide. Prélevez une quantité suffisante de la colonie à étudier avec un manche en platine ou un cure-dent en bois et placez-la sur le disque. Interprétez le changement de couleur entre 10 et 20 secondes.

Utilisation

Le genre Neisseria et Acinetobacter sont parfois très similaires sur le plan morphologique car même si le genre Acinetobacter est un bâtonnet Gram négatif, il peut parfois prendre une forme coccoïde et être distribué par paires, simulant le genre Neisseria.

Dans ce cas, le test de l'oxydase est vraiment utile. Le genre Neisseria est positif et Acinetobacter négatif.

Cependant, le genre Moraxella est très similaire au genre Neisseria et les deux donnent une réaction positive; C'est pourquoi des tests de fermentation des glucides doivent toujours être effectués pour une identification définitive.

D'autre part, le test de l'oxydase est utile pour différencier une bactérie appartenant à la famille des Enterobacteriaceae (toutes oxydase négative) d'autres fermenteurs, tels que le genre Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxydase positive).

Les genres Vibrio et Helicobacter sont également positifs à l'oxydase.

Contrôle de qualité

Utiliser des souches connues d'Escherichia coli comme contrôle négatif et des souches de Pseudomonas aeruginosa comme contrôle positif.

Limites

-Les réactifs doivent être utilisés fraîchement préparés, leur durée de conservation en solution à température ambiante est courte car ils sont très instables. Réfrigérés, ils peuvent durer entre 5 jours et 2 semaines.

-Les réactifs sont incolores, s'ils changent de couleur, ils doivent être jetés. Les disques endommagés apparaissent car ils s'assombrissent avec le temps.

-Une réaction positive avec le réactif Kovacs oxydase entre 15 et 60 secondes est considérée comme une réaction retardée et après 60 secondes, elle doit être considérée comme négative.

-Haemophylus influenzae donne une réaction d'oxydase négative si un réactif contenant de la diméthyl-p-phénylènediamine est utilisé, mais positive si le réactif de Kovacs oxydase (tétraméthyl-p-phénylènediamine) est utilisé.

-Les moyens contenant du glucose interfèrent avec le test, donnant de faux négatifs.

-Les souches de Bordetella pertussis peuvent donner une réaction faussement positive si elles proviennent de plaques de gélose au sang hautement concentrées.

-L'utilisation de poignées en métal (fer) donne une fausse réaction positive.

recommandations

-Parce que les réactifs sont très instables et ont tendance à s'auto-oxyder, il est recommandé de congeler des aliquotes de 1 à 2 ml et de les retirer si nécessaire.

-Une autre façon de retarder l'auto-oxydation du réactif consiste à ajouter 0,1% d'acide ascorbique lors de la préparation des réactifs.

-Les réactifs étant instables, un contrôle qualité hebdomadaire est recommandé.

-Les réactifs qui ne passent pas le test de contrôle qualité ne doivent pas être utilisés.

Références

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2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostic microbiologique Bailey & Scott. 12 éd. Éditorial Panamericana SA Argentine.
3. «Test Oxidase». Wikipedia, l'encyclopédie libre. 15 janv.2018, 10:32 UTC. 3 avril 2019, 14:03
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