COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN: JUSTIFICATION, RÉACTIFS ET TECHNIQUE - LA BIOLOGIE - 2024

Le Ziehl-Neelsen une technique de coloration pour identifier les micro-organismes résistants à l'acide alcoolique (ARA). Le nom de cette procédure de microbiologie fait référence à ses auteurs: le bactériologiste Franz Ziehl et le pathologiste Friedrich Neelsen.

Cette technique est un type de coloration différentielle, qui implique l'utilisation de colorants différents afin de créer un contraste entre les structures que vous souhaitez observer, différencier et identifier plus tard. Le colorant Ziehl-Neelsen est utilisé pour identifier certains types de micro-organismes.

Teinture Ziehl-Neelsen

Certains de ces organismes sont des mycobactéries (par exemple, Mycobacterium tuberculosis), des nocardia (par exemple, Nocardia sp.) Et certains parasites unicellulaires (par exemple, Cryptosporidium parvum). De nombreuses bactéries peuvent être classées grâce à une technique courante appelée coloration de Gram.

Cependant, certains groupes bactériens nécessitent d'autres méthodes pour pouvoir les identifier. Des techniques telles que la coloration Ziehl-Neelsen nécessitent des combinaisons de colorants avec de la chaleur pour fixer le premier à la paroi cellulaire.

Vient ensuite un processus de blanchiment qui permet deux résultats: la résistance ou la sensibilité à la décoloration par les acides et les alcools.

Base

La justification de cette technique de coloration est basée sur les propriétés de la paroi cellulaire de ces micro-organismes. La paroi est composée d'un type d'acides gras appelés acides mycoliques; Ceux-ci se caractérisent par des chaînes très longues.

Lorsque les acides gras ont des structures très longues, ils peuvent retenir plus facilement les colorants. Certains genres bactériens sont très difficiles à colorer par coloration de Gram, en raison de la teneur élevée en acides mycoliques dans la paroi cellulaire.

Le colorant Ziehl-Neelsen utilise le composé phénolique carbol fuchsine, un colorant basique. Cela a la capacité d'interagir avec les acides gras de la paroi cellulaire, qui est de texture cireuse à température ambiante.

La coloration à la fuchsine de carbol est améliorée en présence de chaleur, car la cire fond et les molécules de colorant se déplacent plus rapidement dans la paroi cellulaire.

L'acide qui est utilisé plus tard sert à décolorer les cellules qui n'ont pas été colorées parce que leur paroi n'était pas suffisamment liée au colorant; par conséquent, la force de l'agent de blanchiment acide est capable d'éliminer le colorant acide. Les cellules qui résistent à cette décoloration sont appelées acido-résistantes.

Colorant secondaire

Après décoloration de l'échantillon, il est mis en contraste avec un autre colorant appelé colorant secondaire. Généralement, le bleu de méthylène ou le vert malachite est utilisé.

Le colorant secondaire tache le matériau de fond et crée par conséquent un contraste avec les structures qui ont été colorées lors de la première étape. Seules les cellules décolorées absorbent le second colorant (contre-coloration) et prennent leur couleur, tandis que les cellules acido-résistantes conservent leur couleur rouge.

Cette procédure est fréquemment utilisée pour l'identification de Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae, qui sont appelés bacilles acido-résistants.

Réactifs

Colorant primaire

0,3% de carbol fuchsine (filtré) est utilisé. Ce colorant est préparé à partir d'un mélange d'alcools: phénol dans l'éthanol (90%) ou le méthanol (95%), et dans ce mélange 3 grammes de fuchsine basique sont dissous.

Solution de blanchiment

Dans cette étape, des solutions d'acide alcoolique à 3% ou d'acide sulfurique à 25% peuvent être utilisées.

Colorant secondaire (contre-colorant)

Le colorant le plus utilisé pour contraster les échantillons est généralement 0,3% de bleu de méthylène. Cependant, d'autres peuvent également être utilisés, comme le vert malachite à 0,5%.

Technique

Procédure de coloration acido-résistante

Préparez un frottis bactérien

Cette préparation se fait sur une lame propre et sèche, en suivant les précautions de stérilité.

Séchage de frottis

Laisser sécher le frottis à température ambiante.

Chauffer l'échantillon

L'échantillon doit être chauffé en appliquant le feu sur la lame ci-dessous. Une fixation alcoolique peut être effectuée lorsque le frottis n'a pas été préparé avec des crachats (traités avec de l'hypochlorite de sodium pour le blanchir) et s'il ne va pas se tacher immédiatement.

M. tuberculosis est éliminé avec de l'eau de Javel et pendant le processus de coloration. La fixation par la chaleur des expectorations non traitées ne tuera pas M. tuberculosis, tandis que la fixation de l'alcool est bactéricide.

Couvrir la tache

Le colorant est recouvert de la solution de carbol fuchsine (colorant basique primaire).

Chauffer la tache

Ceci est fait pendant 5 minutes. Vous devriez remarquer une évolution de vapeur (environ 60 ° C). Il est important de ne pas surchauffer et d'éviter de brûler l'échantillon.

En ce qui concerne le chauffage de la tache, il faut faire très attention lors du chauffage de la carbol fuchsine, en particulier si la coloration est effectuée sur un plateau ou un autre récipient dans lequel des produits chimiques hautement inflammables de la coloration précédente ont été collectés.

Seule une petite flamme doit être appliquée sous les lames à l'aide d'un tampon préalablement allumé humidifié avec quelques gouttes d'alcool acide, de méthanol ou d'éthanol à 70%. Évitez d'utiliser un gros coton-tige imbibé d'éthanol car cela présente un risque d'incendie.

Laver la tache

Ce lavage doit être effectué à l'eau claire. Si l'eau du robinet n'est pas propre, laver le frottis avec de l'eau filtrée ou distillée, de préférence.

Couvrir le frottis d'alcool acide

Cet alcool acide doit être à 3%. La couverture est effectuée pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que le frottis soit suffisamment décoloré, c'est-à-dire rose pâle.

Il faut tenir compte du fait que l'alcool acide est inflammable; par conséquent, il doit être utilisé avec grand soin. Évitez d'être à proximité de sources d'ignition.

Laver la tache

Le lavage doit être effectué avec de l'eau distillée propre.

Couvrir le frottis avec une tache

Il peut s'agir d'une coloration au vert malachite (0,5%) ou au bleu de méthylène (0,3%) pendant 1 à 2 minutes, en utilisant le temps plus long si le frottis est mince.

Laver la tache

Encore une fois, de l'eau propre (distillée) doit être utilisée.

Pour drainer

Le dos de la lame doit être nettoyé et la tache placée sur une grille de drainage pour lui permettre de sécher à l'air (ne pas utiliser de papier absorbant pour le séchage).

Examiner le frottis au microscope

Il faut utiliser l'objectif 100X et l'huile d'immersion. Scannez systématiquement le frottis et enregistrez les observations pertinentes.

Interpréter les résultats

Théoriquement, les micro-organismes qui tachent une couleur rougeâtre sont considérés comme acido-résistants (AAR +).

Au contraire, si les micro-organismes se colorent en bleu ou en vert, selon le colorant utilisé comme contre-colorant, ils sont considérés comme négatifs acido-résistants (AAR-).

Références

1. Apurba, S. et Sandhya, B. (2016). Essentials of Practical Microbiology (1ère éd.). Éditeurs médicaux Jaypee Brothers.
2. Bauman, R. (2014). Microbiology with Diseases by Body System (4e éd.). Pearson Education, Inc.
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5. Vasanthakumari, R. (2007). Textbook of Microbiology (1ère éd.). BI Publications PVT.