CYTOCHIMIE: HISTOIRE, OBJET D'ÉTUDE, UTILITÉ ET TECHNIQUES - LA BIOLOGIE - 2025

La cytochimie comprend une série de techniques qui reposent sur l'identification et la disposition de substances spécifiques à l'intérieur de la cellule. Il est considéré comme une branche de la biologie cellulaire qui combine la morphologie cellulaire avec la structure chimique.

Selon Bensley, fondateur de l'application de la cytologie moderne, exprime que le but de la cytochimie est de découvrir l'organisation chimique des cellules afin de comprendre les mystères de la vie. En plus d'étudier les changements dynamiques qui se produisent au cours des différentes étapes fonctionnelles.

1: Maladie extramammaire de Paget. (Hématoxyline-Eosine) 2: plaques séniles observées dans le cortex cérébral chez un patient atteint de la maladie d'Alzheimer. (Imprégnation d'argent) 3: Langue de lapin, fibres de collagène (bleu). Fibres musculaires (bandes violettes). (Trichrome de Masson). 4: Tissu hépatique avec dégénérescence graisseuse. (Soudan III) 5: foie enflammé. Nécrose. (Bleu de toluidine) Sources: Wikipedia. com / Utilisateur: KGH / Fichiers du domaine public / Mohit Lalwani

De cette manière, il est possible de déterminer le rôle métabolique joué par ces substances au sein de la cellule.

La cytochimie utilise deux méthodes principales. Le premier est basé sur des procédures chimiques et physiques. Ces techniques recourent à l'utilisation du microscope comme instrument indispensable pour visualiser les réactions chimiques qui se produisent sur des substances spécifiques dans la cellule.

Exemple: l'utilisation de colorants cytochimiques, comme la réaction de Feulgen ou la réaction PAS, entre autres.

La deuxième méthode est basée sur la biochimie et la microchimie. Avec cette méthodologie, il est possible de déterminer quantitativement la présence de produits chimiques intracellulaires.

Parmi les substances qui peuvent être révélées dans un tissu ou une structure cellulaire, on trouve les suivantes: les protéines, les acides nucléiques, les polysaccharides et les lipides.

Histoire de la cytochimie

Les techniques cytochimiques depuis leur invention ont aidé à comprendre la composition des cellules, et au fil du temps, une variété de techniques ont émergé qui utilisent divers types de colorants avec des affinités et des principes fondamentaux différents.

Par la suite, la cytochimie a ouvert de nouveaux horizons avec l'utilisation de certains substrats pour montrer par colorimétrie la présence d'enzymes ou d'autres molécules au sein de la cellule.

De même, d'autres techniques ont vu le jour comme l'immunocytochimie qui a été d'une grande aide dans le diagnostic de nombreuses maladies. L'immunocytochimie est basée sur des réactions antigène-anticorps.

D'autre part, la cytochimie a également utilisé des substances fluorescentes appelées fluorochromes, qui sont d'excellents marqueurs pour la détection de certaines structures cellulaires. En raison des caractéristiques du fluorochrome, il met en évidence les structures auxquelles il a été attaché.

Qui étudie?

Les différentes techniques cytochimiques utilisées sur un échantillon biologique ont un point commun: elles révèlent la présence d'un type spécifique de substance et connaissent sa localisation au sein de la structure biologique évaluée, qu'il s'agisse d'un type cellulaire ou d'un tissu.

Ces substances peuvent être des enzymes, des métaux lourds, des lipides, du glycogène et des groupes chimiques définis (aldéhydes, tyrosine, etc.).

Les informations fournies par ces techniques peuvent fournir des conseils non seulement pour l'identification des cellules, mais également pour le diagnostic de diverses pathologies.

Par exemple, les colorants cytochimiques sont très utiles pour différencier les différents types de leucémies, car certaines cellules expriment certaines enzymes ou substances clés et d'autres pas.

D'autre part, il convient de noter que pour que l'utilisation de la cytochimie soit possible, les considérations suivantes doivent être prises:

1) La substance doit être immobilisée à l'endroit où elle se trouve naturellement.

2) La substance doit être identifiée à l'aide de substrats qui réagissent spécifiquement avec elle et non avec d'autres composés.

Utilitaire

Les échantillons pouvant être étudiés par des techniques cytochimiques sont:

- Sang périphérique étendu.

- Moelle osseuse étendue.

- Tissus fixés pour les techniques histochimiques.

- Cellules fixées par cytocentrifugation.

Les techniques cytochimiques sont très utiles dans le domaine de l'hématologie, car elles sont largement utilisées pour aider au diagnostic et à la différenciation de certains types de leucémies.

Par exemple: les réactions d'estérase sont utilisées pour différencier la leucémie myélomonocytaire de la leucémie monocytaire aiguë.

Les frottis de moelle osseuse et de sang périphérique de ces patients sont similaires, car certaines cellules sont difficiles à identifier morphologiquement seules. Pour cela, le test d'estérase est réalisé.

Dans la première, les estérases spécifiques sont positives, tandis que dans la seconde, les estérases non spécifiques sont positives.

Ils sont également très utiles en histologie, puisque, par exemple, l'utilisation de la technique de coloration aux métaux lourds (imprégnation à l'argent) colore les fibres réticulaires d'une couleur marron intense dans le tissu myocardique.

Techniques en cytochimie

Les techniques les plus utilisées seront expliquées ci-dessous:

- Utilisation de colorants

Les colorants utilisés sont très diversifiés dans les techniques cytochimiques et ceux-ci peuvent être classés selon plusieurs points de vue:

Selon le radical pour lequel ils ont une affinité

Ils sont divisés en: acide, basique ou neutre. Ce sont les plus simples et les plus utilisés à travers l'histoire, ce qui nous permet de distinguer les composants basophiles des composants acidophiles. Exemple: coloration à l'hématoxyline-éosine.

Dans ce cas, les noyaux des cellules se colorent en bleu (ils prennent de l'hématoxyline, qui est le colorant basique) et les cytoplasmes, en rouge (ils prennent de l'éosine, qui est le colorant acide).

Selon la couleur qu'ils fournissent

Ils peuvent être orthochromatiques ou métachromatiques. Les orthochromatiques sont celles qui tachent les structures de la même couleur que le colorant. Par exemple, le cas de l'éosine, dont la couleur est rouge et les taches rouges.

D'autre part, les colorants métachromatiques structurent une couleur différente de la leur, comme par exemple la toluidine, dont la couleur est bleue et pourtant se colore en violet.

Colorants vitaux ou supravitaux

Ce sont des colorants inoffensifs, c'est-à-dire qu'ils colorent les cellules et qu'ils restent en vie. Ces taches sont appelées vitales (par exemple le bleu trypan pour colorer les macrophages) ou supravitales (par exemple le vert Janus pour colorer les mitochondries ou le rouge neutre pour colorer les lysosomes).

- Détection des lipides au moyen de colorants liposolubles

Tétroxyde d'osmium

Il tache les lipides (acides gras insaturés) en noir. Cette réaction peut être observée avec le microscope optique, mais comme ce colorant est de haute densité, il peut également être visualisé avec un microscope électronique.

Soudan III

C'est l'un des plus utilisés. Ce colorant diffuse et se solubilise dans les tissus, s'accumulant à l'intérieur des gouttelettes lipidiques. La couleur est rouge écarlate.

Tache noire Soudan B

Il produit un meilleur contraste que les précédents car il est capable de se dissoudre également dans les phospholipides et le cholestérol. Il est utile pour détecter des granules azurophiles et spécifiques de granulocytes matures et de leurs précurseurs. Par conséquent, il identifie les leucémies myéloïdes.

- Coloration du groupe aldéhyde (coloration de Schiff à l'acide périodique)

La coloration de Schiff à l'acide périodique peut détecter trois types de groupes aldéhydiques. Ils sont:

- Aldéhydes libres, naturellement présents dans les tissus (réaction plasmatique).

- Aldéhydes produits par oxydation sélective (réaction PAS).

- Aldéhydes générés par hydrolyse sélective (réaction de Feulgen).

Réaction PAS

Cette coloration est basée sur la détection de certains types de glucides, comme le glycogène. L'acide périodique Schiff rompt les liaisons CC des glucides en raison de l'oxydation des groupes glycoliques 1-2, parvenant à libérer des groupes aldéhyde.

Les groupes aldéhyde libres réagissent avec le réactif de Schiff et forment un composé rouge pourpre. L'apparition de la couleur violet-rouge montre une réaction positive.

Ce test est positif dans les cellules végétales, détectant l'amidon, la cellulose, l'hémicellulose et les peptines. Dans les cellules animales, il détecte les mucines, les mucoprotéines, l'acide hyaluronique et la chitine.

De plus, il est utile dans le diagnostic des leucémies lymphoblastiques ou de l'érythroleucémie, entre autres pathologies de type myélodysplasique.

Dans le cas des glucides acides, le colorant bleu alcien peut être utilisé. Le test est positif si une couleur bleu clair / turquoise est observée.

Réaction plasmique

La réaction plasmatique révèle la présence de certains aldéhydes aliphatiques à longue chaîne comme le palmier et le stéaral. Cette technique est appliquée sur des coupes histologiques congelées. Il est traité directement avec le réactif de Schiff.

Réaction de Feulgen

Cette technique détecte la présence d'ADN. La technique consiste à soumettre le tissu fixé à une hydrolyse acide faible pour le faire réagir plus tard avec le réactif de Schiff.

L'hydrolyse expose les groupes désoxyribose aldéhyde au niveau de la liaison désoxyribose-purine. Le réactif de Schiff réagit alors avec les groupes aldéhyde qui sont restés libres.

Cette réaction est positive dans les noyaux et négative dans les cytoplasmes des cellules. La positivité est mise en évidence par la présence d'une couleur rouge.

Si cette technique est associée au vert de méthyle-pyronine, il est possible de détecter simultanément l'ADN et l'ARN.

- Colorants cytochimiques pour les structures protéiques

Pour cela, la réaction de Millon peut être utilisée, qui utilise du nitrate de mercure comme réactif. Les structures contenant des acides aminés aromatiques tacheront en rouge.

- Colorants cytochimiques utilisant des substrats pour montrer la présence d'enzymes

Ces colorations sont basées sur l'incubation de l'échantillon biologique avec un substrat spécifique et le produit de réaction réagit ensuite avec des sels diazo pour former un complexe coloré.

Estérases

Ces enzymes sont présentes dans les lysosomes de certaines cellules sanguines et sont capables d'hydrolyser les esters organiques libérant du naphtol. Ce dernier forme un colorant azoïque insoluble lorsqu'il se lie à un sel diazo, colorant le site où se produit la réaction.

Il existe plusieurs substrats et selon celui qui est utilisé, des estérases spécifiques et des estérases non spécifiques peuvent être identifiées. Les premiers sont présents dans les cellules immatures de la série myéloïde et les seconds dans les cellules d'origine monocytaire.

Le substrat utilisé pour la détermination d'estérases spécifiques est: le chloroacétate de naphtol-AS-D. Alors que pour la détermination des estérases non spécifiques, plusieurs substrats peuvent être utilisés tels que l'acétate de naphtol AS-D, l'acétate d'alpha-naphtyle et le butyrate d'alpha-naphtyle.

Dans les deux cas, les cellules se colorent en rouge foncé lorsque la réaction est positive.

Myéloperoxydase

Cette enzyme se trouve dans les granules azurophiles des cellules granulocytaires et des monocytes.

Sa détection permet de différencier les leucémies d'origine myéloïde des lymphoïdes. Les cellules contenant des myéloperoxydases virent au jaune ocre.

Phosphatases

Ces enzymes libèrent des acides phosphoriques à partir de différents substrats. Ils diffèrent les uns des autres selon la spécificité du substrat, le pH et l'action des inhibiteurs et des inactivateurs.

Parmi les plus connues figurent les phosphomonoestérases qui hydrolysent les esters simples (PO). Exemple: phosphatase alcaline et phosphatase acide, ainsi que phosphamidases qui hydrolysent les liaisons (PN). Ceux-ci sont utilisés pour différencier les syndromes lymphoprolifératifs et pour le diagnostic de la leucémie à cellules velues.

- Colorations trichromiques

Trichrome de Mallary-Azan

Ils sont utiles pour différencier le cytoplasme des cellules des fibres du tissu conjonctif. Les cellules se colorent en rouge et les fibres de collagène en bleu.

Trichrome de Masson

Cela a la même utilité que le précédent mais, dans ce cas, les cellules se colorent en rouge et les fibres de collagène en vert.

- Colorants qui tachent des organites spécifiques

Janus Green

Il colore sélectivement les mitochondries.

Sels d'argent et acide osmique

Tache l'appareil de Golgi.

Bleu de toluidine

Tache les corps de Nissi

Sels d'argent et PAS

Ils tachent les fibres réticulaires et la lame basale.

Orcéine et résorcine fuchsine

Ils teignent les fibres élastiques. Avec le premier ils sont teints en brun et avec le second en bleu profond ou violet.

- Autres techniques utilisées en cytochimie

Utilisation de substances fluorescentes ou de fluorochromes

Il existe des techniques qui utilisent des substances fluorescentes pour étudier l'emplacement d'une structure dans une cellule. Ces réactions sont visualisées avec un microscope spécial appelé fluorescence. Exemple: technique IFI (Immunofluorescence indirecte).

Détection des composants cellulaires par immunocytochimie

Ces techniques sont très utiles en médecine car elles aident à détecter une certaine structure cellulaire et à la quantifier. Cette réaction est basée sur une réaction antigène-anticorps. Par exemple: Techniques ELISA (Enzyme Immuno Assay).

recommandations

- Il est nécessaire d'utiliser des frottis de contrôle pour évaluer les bonnes performances des colorants.

- Des frottis frais doivent être utilisés pour subir une coloration cytochimique. Si ce n'est pas possible, ils doivent être conservés à l'abri de la lumière et conservés à 4 ° C.

- Il faut veiller à ce que le fixateur utilisé n'influence pas négativement la substance à analyser. En d'autres termes, il faut l'empêcher de pouvoir l'extraire ou l'inhiber.

- Le temps d'utilisation des fixateurs doit être respecté, car en général il ne doit durer que quelques secondes, car une exposition plus longue du frottis au fixateur peut endommager certaines enzymes.

Références

1. «Cytochemistry». Wikipedia, l'encyclopédie libre. 30 juin 2018, 17:34 UTC. 9 juil.2019, 02:53 Disponible sur: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Méthodes d'imprégnation métalliques pour l'étude des fibres réticulaires myocardiques: étude comparative. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Disponible sur: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Cytochimie de la phosphatase acide: considérations méthodologiques. Rev Diagn Biol.200; 50 (2): 89-92. Disponible sur: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Biologie cellulaire et moléculaire. 11e édition. Éditorial Ateneo. Buenos Aires, Argentine.
5. Outils classiques pour étudier la biologie cellulaire. TP 1 (matériel supplémentaire) - Biologie cellulaire. Disponible sur: dbbe.fcen.uba.ar