BOUILLON D'URÉE: FOND DE TEINT, PRÉPARATION ET UTILISATIONS - LA BIOLOGIE - 2025

Le bouillon d'urée est un milieu de culture liquide, utilisé pour détecter la présence d'enzyme uréase dans certains microorganismes. L'uréase est une enzyme microbienne qui est produite de manière constitutive, c'est-à-dire qu'elle est synthétisée indépendamment de la présence ou non du substrat sur lequel elle agit.

La fonction de l'uréase est liée à la décomposition des composés organiques. Tous les microorganismes ne sont pas capables de synthétiser cette enzyme, donc sa détermination en laboratoire permet d'identifier certaines souches bactériennes et même de différencier les espèces du même genre.

Test d'urée négatif et positif. Source: Photo prise par l'auteur MSc. Marielsa Gil.

Il existe deux types de test d'urée: Stuart et Christensen. Ils diffèrent par leur composition et leur sensibilité. Le premier est spécial pour montrer une grande quantité d'uréase produite par des espèces du genre Proteus.

Le second est plus sensible et peut détecter de petites quantités d'uréase générées tardivement par d'autres genres bactériens, tels que Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter et Mycobacterium.

Le bouillon d'urée de Stuart est composé d'urée, de chlorure de sodium, de phosphate dipotassique, de phosphate monopotassique, d'extrait de levure, de rouge de phénol et d'eau distillée.

Pendant ce temps, le bouillon ou l'agar d'urée de Christensen est composé de peptones, de chlorure de sodium, de phosphate monopotassique, de glucose, d'urée, de rouge de phénol, d'eau distillée et d'agar-agar. Ce dernier uniquement s'il s'agit du milieu solide.

Base

L'enzyme uréase hydrolyse l'urée pour former du dioxyde de carbone, de l'eau et deux molécules d'ammoniaque. Ces composés réagissent pour former le produit final appelé carbonate d'ammonium.

Bouillon d'urée de Stuart

Le bouillon d'urée de Stuart est plus tamponné avec un pH de 6,8. Par conséquent, le micro-organisme doit être capable de former de grandes quantités d'ammoniac pour devenir rouge phénol. Le pH doit dépasser 8.

Par conséquent, le bouillon d'urée de Stuart est sélectif pour les espèces Proteus, donnant des résultats positifs dans les 24 à 48 heures d'incubation, et il n'est pas efficace pour les bactéries qui produisent de faibles quantités d'uréase ou qui hydrolysent lentement l'urée.

En effet, les espèces Proteus sont capables d'utiliser l'urée comme source d'azote. Au lieu de cela, d'autres bactéries productrices d'uréase ont besoin d'une source supplémentaire.

Cependant, Pérez et al. (2002) ont déterminé que le bouillon d'urée de Stuart était aussi efficace que l'agar d'urée de Christensen pour déterminer l'uréase dans les souches de levure des genres Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon et Saccharomyces.

Les auteurs de l'étude affirment avoir atteint un accord de 100% avec les deux milieux (Stuart et Christensen) lors de l'incubation pendant 24 et 48 heures; à l'exception que les souches qui ont réussi à transformer le support en une forte couleur rose-fuchsia ont été considérées comme positives.

Cette clarification est nécessaire, puisque Lodder (1970) a déclaré que presque toutes les levures parviennent à transformer le biseau de gélose à l'urée Christensen en rose pâle. Cela est dû au fait qu'ils peuvent hydrolyser l'urée en quantités minimales et à la formation d'amines par décarboxylation oxydative d'acides aminés en surface. Cela ne doit pas être interprété comme positif.

Gélose ou bouillon à l'urée de Christensen

Le bouillon ou la gélose à l'urée de Christensen est moins tamponné, étant capable de détecter de petites quantités d'ammoniac. De plus, ce milieu est enrichi en peptones et en glucose. Ces composés provoquent la croissance d'autres micro-organismes producteurs d'uréase qui ne se développent pas dans le bouillon Stuart.

De même, le test d'urée de Christensen offre des résultats plus rapides, en particulier pour Proteus, étant capable de donner un résultat fortement positif en seulement 30 minutes comme temps minimum et jusqu'à 6 heures comme temps maximum.

Le reste des microorganismes producteurs d'uréase parvient à changer la couleur du milieu légèrement après 6 heures, et fortement après 24, 48, 72 heures ou plus, et même certaines souches peuvent donner de faibles réactions après 5 ou 6 jours.

Interprétation des deux médias (Stuart et Christensen)

Le support est à l'origine de couleur jaune-orange et une réaction positive transformera la couleur du support en rose-fuchsia. L'intensité de la couleur est directement proportionnelle à la quantité d'ammoniac produite.

Une réaction négative laissera le milieu de la couleur d'origine à l'exception des levures, qui peuvent virer au rose pâle sur le milieu gélose urée de Christensen.

préparation

Bouillon d'urée de Stuart

Pesez les grammes nécessaires selon les indications de la société commerciale. Dissoudre dans de l'eau distillée de préférence stérile. N'utilisez pas de chaleur pour dissoudre, car l'urée est sensible à la chaleur.

La filtration sur membrane est utilisée pour stériliser. Pour cela, un filtre Millipore avec des pores de 0,45 µ de diamètre est utilisé. N'utilisez pas d'autoclave. Une fois la solution filtrée, elle est distribuée dans des tubes stériles. Pour obtenir des résultats fiables, il doit être transféré entre 1,5 ml comme quantité minimale et 3 ml comme quantité maximale par tube.

Conserver au réfrigérateur et réchauffer avant utilisation.

Si la méthode de filtration n'est pas disponible, le milieu doit être utilisé immédiatement pour obtenir des résultats fiables.

Une autre façon de préparer le bouillon d'urée de Stuart est la suivante:

Certaines maisons commerciales vendent le milieu de base pour le test d'urée, sans l'urée.

La quantité indiquée par la société commerciale est pesée. Il est dissous dans de l'eau distillée et stérilisé dans l'autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes. On laisse reposer un peu et lorsque le milieu est chaud, ajouter 100 ml d'une solution d'urée préparée à 20% et stérilisée par filtration.

Il est distribué dans des tubes stériles, comme décrit précédemment.

Gélose ou bouillon à l'urée de Christensen

-Préparation de la solution d'urée

Peser 29 g d'urée déshydratée et dissoudre dans 100 ml d'eau distillée. Utilisez la méthode de filtration pour stériliser. Ne pas autoclave.

-Gélose à base d'urée

Dissoudre 24 g de gélose de base déshydratée dans 950 ml d'eau distillée. Stériliser à l'autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes. Laisser reposer jusqu'à ce qu'il atteigne une température de 50 ° C et ajouter l'urée préalablement préparée de manière aseptique.

Versez 4 à 5 ml dans des tubes stériles et inclinez-les jusqu'à ce qu'ils soient solides. Il devrait y avoir un long bec de flûte.

Ce milieu peut également être préparé sous forme liquide.

Applications

Le test à l'urée est extrêmement efficace pour distinguer le genre Proteus des autres genres de la famille des Enterobacteriaceae, étant donné la réaction rapide fournie par Proteus.

En utilisant la composition de Christensen, le test permet de différencier les espèces du même genre. Par exemple, S. haemolyticus et S. warneri sont des staphylocoques à coagulase négative et bêta-hémolytique, mais diffèrent en ce que S. haemolyticus est urée négatif et S. warneri est urée positif.

D'autre part, McNulty a utilisé avec succès le bouillon d'urée à 2% de Christensen pour étudier la présence d'Helicobacter pylori dans des échantillons de biopsie prélevés sur la muqueuse gastrique (région antrale).

La présence de H. pylori est mise en évidence par un test urée positif. La durée d'observation des résultats est directement proportionnelle à la quantité de micro-organismes présents.

Comme on peut le voir, il s'agit d'une méthode simple pour le diagnostic d'Helicobacter pylori dans les biopsies gastriques.

Enfin, ce test est également utile pour différencier les espèces des genres Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus et Mycobacteria.

Semer le test d'urée

Les deux méthodes nécessitent un inoculum microbien puissant pour optimiser les résultats. Les colonies bactériennes sont de préférence prélevées sur gélose au sang et des levures sur gélose Sabouraud, à quelques exceptions près. L'inoculum est émulsionné dans le milieu liquide.

Pour le bouillon d'urée de Stuart, incuber à 37 ° C pendant 24 à 48 heures, sachant que vous ne recherchez que des souches du genre Proteus lorsque la souche est une bactérie. Pour les levures, il peut être incubé à 37 ° C ou à température ambiante pendant 24 à 48 heures d'incubation.

Dans le cas du bouillon d'urée de Christensen, il est incubé à 37 ° C pendant 24 heures. Si le test est négatif, il peut être incubé jusqu'à 6 jours. Si le test est positif avant 6 heures, cela indique qu'il s'agit d'une souche du genre Proteus.

Dans le cas de la gélose à l'urée de Christensen, le biseau de l'agar est fortement ensemencé, sans perforation. Le bouillon est incubé et interprété de la même manière.

Contrôle de qualité

Des souches témoins telles que Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 et Salmonella typhimurium peuvent être utilisées pour tester le milieu. Les deux premiers devraient donner des résultats positifs et les deux derniers résultats négatifs.

Source: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostic microbiologique. 5e éd. Éditorial Panamericana SA Argentine.

Références

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Utilisation du bouillon d'urée de Stuart pour le test d'uréase, comme test dans le diagnostic de la levure. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Disponible sur: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Tests biochimiques pour l'identification des bactéries d'importance clinique. 3e éd. Éditorial Panamericana. Buenos Aires. Argentine.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostic microbiologique Bailey & Scott. 12 éd. Éditorial Panamericana SA Argentine.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostic microbiologique. 5e éd. Éditorial Panamericana SA Argentine.
5. Laboratoires Britannia. Christensen Medium (base de gélose à l'urée) 2015. Disponible sur: britanialab.com