BOUILLON MALONATE: FOND DE TEINT, PRÉPARATION ET UTILISATIONS - LA BIOLOGIE - 2024

Le bouillon malonate est le milieu de culture liquide utilisé pour le test diagnostique (malonate), utilisé pour différencier certains genres de la famille des Enterobacteriaceae. Il a été créé par Leifson en 1933 et modifié plus tard par Ewing, qui a ajouté une petite quantité de dextrose et d'extrait de levure à la formule originale.

Le milieu est actuellement composé d'extrait de levure, de sulfate d'ammonium, de phosphate dipotassique, de phosphate monopotassique, de chlorure de sodium, de malonate de sodium, de dextrose et de bleu de bromothymol. Ce test est généralement inclus dans la batterie d'identification biochimique des Enterobacteriaceae, permettant de différencier certains genres et espèces.

Représentation graphique du test malonate. A. Test négatif, B. (acidification) Test négatif, C. (alcalinisation moyenne) Test positif. Source: Tubes de couleur publicdomainpictures.net

Le test du malonate est principalement basé sur la capacité de certains microorganismes à utiliser le malonate de sodium comme seule source de carbone et le sulfate d'ammonium comme source d'azote.

Le test malonate est généralement positif chez certaines espèces des genres Enterobacter, Klebsiella et Citrobacter. Alors que la plupart des espèces des genres Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus et Providencia, donnent une réaction négative.

Base

Le test du malonate consiste à mettre en évidence les bactéries capables d'utiliser le malonate de sodium comme seule source de carbone et le sulfate d'ammonium comme source d'azote.

La plupart des entérobactéries qui n'utilisent pas de malonate sont capables de se développer dans ce milieu, en prenant du dextrose et de l'extrait de levure comme nutriments.

Dans ce cas, toute tentative d'alcalinisation par l'utilisation de peptones sera contrecarrée par la production d'acides générés par la fermentation du dextrose. De même, les phosphates dipotassiques et monopotassiques agissent comme un tampon, maintenant le pH à 6,7.

C'est pourquoi, lorsque le test est négatif, le bouillon reste de la même couleur d'origine (vert). En de rares occasions, le milieu peut devenir acide en raison de la fermentation du dextrose; sans l'utilisation des peptones et de l'indicateur de pH, la couleur du milieu deviendrait jaune. Pour que cela se produise, le pH doit descendre à 6.

Cependant, lorsque ce test est positif, on dit que le microorganisme utilise respectivement le malonate et le sulfate d'ammonium comme sources de carbone et d'azote, sans utiliser les autres composants.

Dans ce cas, le milieu devient alcalin en raison de la libération de sodium et de la formation conséquente de NaOH. En ce sens, l'indicateur de pH (bleu de bromothymol) fait passer la couleur du milieu du vert au bleu lorsque le pH est égal ou supérieur à 7,6. Le bleu peut être léger ou intense (bleu de Prusse).

Enfin, le chlorure de sodium maintient l'osmolarité du milieu et l'eau est le diluant de tous les composants.

Interprétation

Bouillon de même couleur (vert) - Test négatif

Bouillon jaune: test négatif

Bouillon bleu clair ou bleu foncé: test positif

Il existe une variante appelée bouillon de malonate de phénylalanine, également appelée milieu de Shaw et Clarke. Dans ce cas, deux tests peuvent être analysés, l'utilisation du malonate comme source de carbone et la production d'acide pyruvique à partir de la phénylalanine.

préparation

Bouillon malonate

Le nombre de grammes spécifié par l'insert de la société commerciale choisie est pesé (il peut varier de l'un à l'autre). Les grammes pesés sont mis en suspension dans un litre d'eau distillée. Chauffer légèrement jusqu'à dissolution complète. Répartir 3 ml de milieu dans des tubes à essai 13/100 avec des bouchons en coton.

Stériliser en autoclave à 121 ° C pendant 15 à 20 minutes.

Laisser refroidir avant utilisation. S'ils ne doivent pas être utilisés immédiatement, conservez-les au réfrigérateur jusqu'à leur utilisation. Amenez les bouillons à température ambiante avant d'inoculer.

Le pH du milieu doit être de 6,7 ± 0,2. La couleur du milieu préparé est vert bouteille.

Bouillon de malonate de phénylalanine

Peser 11 g de milieu déshydraté et dissoudre dans 1 litre d'eau distillée. Le reste de la préparation est le même que celui décrit précédemment.

Il peut également être préparé en ajoutant 2 g / L de phénylalanine au milieu de bouillon malonate avant sa stérilisation.

Utilisation

Il est utilisé dans le cadre de la batterie de tests biochimiques qui sont assemblés pour l'identification des bactéries de la famille des Enterobacteriaceae.

Aide à distinguer:

-Le genre Klebsiella et Enterobacter (+) du genre Escherichia et Serratia (-).

-Les espèces de Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica ssp salame et Salmonella enterica ssp diarizonae (+), de l'espèce Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Du genre Klebsiella généralement (+) du genre Actinobacillus (-).

-Occasionnellement, il peut aider à différencier les genres et les espèces de bactéries qui n'appartiennent pas à la famille des Enterobacteriaceae, comme entre les bacilles Gram négatifs non fermentants Alcaligenes faecalis (+) et Acinetobacter sp (-).

Source: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostic microbiologique. 5e éd. Éditorial Panamericana SA Argentine.

Processus

Sous un briquet, une partie d'une eau de Cologne pure est prise, à l'aide d'une poignée en platine correctement stérilisée et refroidie. L'échantillon prélevé (inoculum léger) est dissous dans le bouillon malonate. Incuber avec le couvercle lâche en aérobiose à 35 ° C ± 0,2 pendant 24 à 48 heures.

Le bouillon de malonate peut également être inoculé à partir d'une culture de 18 à 24 heures dans un bouillon de soja trypticase. Dans ce cas, 0,01 ml est prélevé avec une pipette stérile et le bouillon malonate est ensemencé. Incuber avec le couvercle lâche en aérobiose à 35 ° C ± 0,2 pendant 24 à 48 heures.

À la fin du temps, les résultats sont interprétés. Toute trace de couleur bleue après 48 heures d'incubation doit être considérée comme positive. Le test ne doit pas être interprété comme négatif tant que le temps d'incubation de 48 heures n'est pas écoulé.

Dans le cas de l'utilisation de la variante de bouillon de phénylalanine malonate, le malonate est d'abord interprété puis 5 gouttes de HCl 1 N et 3 à 5 gouttes de chlorure ferrique à 8% sont ajoutées. Une couleur vert foncé est interprétée comme un test positif pour la phénylalanine. Si, au contraire, le milieu vire au bleu pâle, le test est négatif pour la phénylalanine.

Contrôle de qualité

Pour effectuer le contrôle de stérilité du milieu, un ou deux bouillons doivent être incubés à 35 ° C ± 0,2 pendant 24 heures d'incubation. Passé ce délai, il ne devrait y avoir aucun trouble ni changement de couleur.

Pour le contrôle qualité, des souches connues ou certifiées peuvent être utilisées, telles que: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 et Escherichia coli ATCC 25922.

Les résultats attendus sont:

• Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae et Salmonella enterica ssp arizonae donnent une réaction positive (couleur bleu moyen).
• Pour Escherichia coli, le résultat doit être négatif, c'est-à-dire qu'il n'y aura pas de changement de couleur (vert) ou qu'il deviendra jaune en raison de la fermentation du glucose.

Limites

N'utilisez pas de bouillon présentant de la turbidité, des précipités, un changement de couleur ou tout signe de détérioration.

Références

1. Pedraza J, Sanandres N, Varela Z, Aguirre E, Camacho J. Isolement microbiologique de Salmonella spp. et des outils moléculaires pour sa détection. Uninorte Health. Barranquilla (Col.) 2014; 30 (1): 73-94. Disponible sur: scielo.org.co
2. BBL. Bouillon de malonate, Ewing modifié. 2007. Disponible sur: bd.com
3. Laboratoires Senna. Bouillon Malonato. Disponible sur: cientificasenna.com
4. RenyLab. Bouillon Malonato. 2013. Disponible sur: es.renylab.ind.br
5. Diagnostics Mbiolog. Bouillon Malonato. Disponible sur: mbiolog.com
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostic microbiologique. 5e éd. Éditorial Panamericana SA Argentine.
7. Laboratoires Conda Pronadisa. Bouillon de malonate de phénylalanine. Disponible sur: condalab.com